第1章小鼠早期胚胎细胞的命运决定

YojiroYamanaka !AmyRalston

摘要：发育过程中，最初的胚胎全能干细胞特异性地形成独立的组织胚层。小鼠中形成的及时胚系是胚外组织。同时，没有成为胚外层的细胞仍保留多能干性，它们可以形成胚胎的所有胚层。多能干细胞系来源于胚胎的几个发育阶段。有趣的是，在同一时期胚外层已经有多能干细胞系了。因此，检测早期胚胎细胞命运决定的调控是研究干细胞系建立的一个难得的机会。以往的研究为前三个胚层的形成提出了深刻的见解，而现代分子成像技术的运用进一步推动了这一领域的发展。本章我们将介绍目前所发现的小鼠发育过程早期三个胚层建立和维持的多样的分子机制。

引言

在小鼠发育的初期，最初全能细胞的发育潜力是受到限制的，仅发育成小鼠及时胚层。而在非哺乳动物物种中，及时胚层的建立则可能涉及主体轴的形成，哺乳动物的不同在于其首先要完成着床。因此，几天内胚胎和胚外组织之间的差异包括了前两个胚层决定(图1-1)及之前胚层(外胚层、中胚层、内胚层)和胚系的建立。这种独特的哺乳动物发育模式涉及一种独特的细胞类型，可以从中分离出来并扩增为稳定的细胞系。因此，认识胚外组织的起源有助于我们了解干细胞的形成与分化。以往的研究对前三个胚层的形成提出了颇具洞察力的见解，而利用现代分子生物学和成像技术将进一步推进这一领域的发展。

受精后第三天，小鼠胚胎(囊胚)包含三个组织系：外胚层(EPI)、滋养层(TE)和原始内胚层(PE)。对来源于这些胚层的干细胞系的分离和研究加深了我们对早期胚胎细胞命运决定的认识。已经从囊胚中分离得到三类干细胞系：胚胎干细胞、滋养层干细胞和胚外内胚层干细胞(ES细胞、TS细胞和XEN细胞)。它们均具有干细胞自我更新及分化为各类成熟细胞等的特性。同时，每种干细胞系仍保有与其来源相关的特性，包括组织特异性的发育潜力、形态、转录因子表达和生长因子需求\这些干细胞系的提出不仅为那些需要大量初始原料的研究提供了可扩增的纯细胞群，也是了解干细胞起源的一个契机。

从胚胎干细胞的研究中我们可以对细胞命运选择基因进行更深入的分子水平分析。

操控某一特定种系调节基因可以引起干细胞发生相应的命运改变。例如，一个滋养细胞转录因子Cdx2就足够使ES细胞转变成TS-样的细胞2。这类研究表明ES细胞具有很强的可塑性，以及作为胚层决定因子Cdx2基因的核心作用。胚胎干细胞也为研究胚层决定基因之间的分子相互作用提供了一个机会，从而成为认识胚胎的细胞命运选择的模式。然而，在胚层决定基因的研究中发现其发挥作用主要在相对晚期，因此便提出胚胎早期是如何决定三个胚层的疑问。

参与及时胚层形成的机制可能有很多种，包括细胞的位置、形状、极化、信号和分裂面。在新提出的模式中，早期的前干细胞程序使组织胚层特异性形成囊胚。而在着床及以后，细胞命运则由干细胞系中的一个活化程序所掌控(图1-2)。

胚层的建立和前干细胞程序：囊胚的形成

这里我们将讨论胚层形成的及时个阶段：TE和内细胞团(ICM)的形成共同组成囊胚。TE将分化为胎盘，而ICM是胚胎和原始内胚层祖细胞的混合物。在囊胚中，TE围绕ICM和中空的囊胚腔，胚层示踪实验表明TE和ICM细胞群是从胚胎的内外细胞群开始发育3。受精卵细胞分裂为2、4、8和16细胞，这群少量的细胞被外细胞包围。通过连续分裂，内外细胞的数量增加，TE上皮化和囊胚腔扩张，形成囊胚结构。

拓扑结构如何与细胞的命运相连系的机制尚不清楚，目前已经提出了几种模型。例如，细胞的命运可能是细胞位置的结果(图1-3A);或者预先确定的细胞的命运可以驱使细胞到适当的拓扑学位置(图1-3B)。随后的机制预测了在内外细胞群形成之前就可以检测到前内细胞和前外细胞。然而，尽管人们在这一领域付出了相当多的努力，但目前还没有找到支持这个预先确定机制的证据。

胚层示踪法与分子分析法作为两个主要的研究策略，被运用于寻找关于囊胚期之前的细胞存在预定理论的证据。在胚层示踪方面，对两种细胞共存阶段的细胞研究发现，两细胞之间有偏差的发育潜能和TE/ICM的胚层决定是不相关的，这是因为这两个细胞均参与了TE和ICM的形成4"13。同样，4细胞阶段、8细胞阶段的所有细胞也参与了TE和ICM胚层的形成14，15。虽然有报道认为4细胞阶段胚层的发育潜能受到了限制7，因而胚外层没有形成，然而胚层示踪实验没有找到证据证明在内外细胞群形成之前细胞被预先确定为TE或ICM细胞。至于分子分析方面，在16细胞阶段之前的细胞亚群中，没有检测到可以调控TE/ICM的胚层决定的蛋白质。在4细胞阶段的卵裂球中存在一种组蛋白甲基化水平分布不均，这与嵌合体的小鼠的生育能力降低有关16，而其在TE/ICM形成中的功能重要性仍然有待阐明。所以，也没有分子证据表明在内外细胞群形成之前有前TE细胞或前ICM细胞的存在。相反，当内外细胞群确定了其在胚胎中的位置时，便确立了它未来的发育方向。

如果是细胞位置决定细胞发育方向，那一定存在细胞感应胚胎内位置的机制。长期的研究结果表明细胞在8细胞阶段极化17，这个理论认为内/外轴在细胞水平上存在差异。被保守的极性蛋白如非典型蛋白激酶C(aPKC)、Par3和Pa6极化是维持细胞位置所必需的8，细胞接触则是细胞极化所必需的17。但还没有分子水平上的证据来确认位置、极化和细胞命运之间的联系。利用常规的基因敲除技术来研究这个领域是具有挑战性的。与细胞位置、细胞接触相关的许多蛋白质是大的基因家族的成员，如aPKC，这表明单基因敲除可能会被遗传丰余所掩盖。此外，早期发育阶段部分是通过母体提供的蛋白质调控的，因此需要敲除生殖细胞的基因来确定表型。，许多这类蛋白质参与了细胞基本过程如细胞分裂，这使得在发育的过程中研究其功能变得困难。再者，显性抑制或siRNA的过表达会导致短期或局部功能丧失，这也将阻碍表型的确立。

最终需要一个不同的定位转录因子来将内/外差异转换成基因表达的变化。确定早期胚层发育相关的转录因子有以下几个策略：利用芯片分析着床前的转录表达来确定候选的转录因子，随后通过原位杂交筛选囊胚中表达受限的候选因子18;或者通过对囊胚来源的干细胞系进行基因芯片比较来筛选候选因子19。还有就是通过敲除来偶然发现早期致死表型，Cdx2和Tead42e"22便是这样发现的。

虽然TE的发育需要Cdx2，但是Cdx2可能在TE的形成中没有起到决定性的作用23，24。研究表明Cdx2mRNA25定位在8细胞阶段的细胞外表面，但Cdx2蛋白2426却没有。在没有Cdx2的胚胎中，TE的标记Gata3仍持续表达19，这说明无论是形态学上23，24还是分子水平上，Cdx2都不是TE所必需的，很难相信定位的Cdx2mRNA的表达会在胚层确立中起决定性作用。最近一个与Tead4及辅助因子相关的新的通路被证明在及时胚层决定中发挥了决定性作用。在Cdx2表达的激活中，转录共激活子Yap和相关蛋白Taz，表现出对细胞位置敏感的变化27。在囊胚期之前，Yap/Taz定位在外细胞的细胞核和内细胞的细胞质，这一定位是由Hippo信号通路成员Latsl/2的磷酸化来调节的。此外，改变细胞位置会导致Yap定位的相应变化：外细胞嵌入内部，细胞聚集并失去核Yap，而内细胞脱离了周围的外细胞并获得核Yap。Tead4是一种DNA结合蛋白，Yap/Taz与Tead4的直接相互作用是Cdx221，22和其他滋养层标记19表达所必需的。虽然Yap/Taz调节信号感知细胞位置的特性或者本质仍然未知，但Hippo信号通路以及与细胞接触有关的蛋白质如钙黏蛋白可能参与了这一过程，这无疑将是一个令人兴奋的研究领域。

目前已经清楚了Yap/Tead4的上游通路，而对它的下游通路还不清楚。tead4是Cdx2表达所必需的，缺失Tead4的胚胎不能形成囊胚，而Cdx2敲除的胚胎在囊胚形成后死亡。Tead4在ICM中不是必需的21，22，所以一定还有其他的基因与TE中的Cdx2同时作用。目前已经开始研究一些基因，如Gata3X今后寻找参与促进外细胞增殖和构建囊胚的Tead4的靶点将是重要的研究方向。

胚系的维持和干细胞程序：囊胚以外在囊胚中，早期阶段的胚系决定转录子之间相互作用加强了TE和ICM的命运的建立。在这个阶段起中心作用的是Oct4(Pou5fl$和Glr2。Oct4是ICM成熟所必需的SCdx2是TE成熟所必需的23。初步推测这两个因子之间的相互制约导致了及时胚层的命运决定。在囊胚的TE中，Cdx2抑制O"4和其他ICM的基因的表达23。但在Cdx2缺失的胚胎中，TE仍然可以形成，其他TE的标记也仍然表达19。同样，在着床后囊胚形成1天后，ICM中的Oct4抑制Cdx2的表达19。因此，在没有Oct4或Cd.时胚层发育的最初是正常的，但胚胎不能正常表达胚层基因。Cd-2缺失的胚胎尽管表达ICM基因，却不遵照ICM的命运发育。在Cdx2缺失的胚胎TE中，TE的标记Gata3仍表达19，但此胚胎的凋亡水平比野生型高23。因此可以肯定的是，Cdx2维持了那些将发育成TE的细胞的存活和增殖。与此一致的是，Cdx2在后期的滋养层细胞增殖区持续表达29。O#表达缺失的胚胎不能存活，其原因目前尚未明确。

O#4和Cdx2之间的制约关系在来源于囊胚的干细胞中得到了证实。O"4缺失的胚胎中没有ES细胞，Cdx2缺失的胚胎没有TS细胞23，28。已有的ES细胞缺失O"4后会导致Cdx2的上调，并在TS细胞培养基中形成TS-样细胞3°。同样，在ES细胞中过表达Cdx2会导致Oc4表达抑制并形成TS-样细胞2。在ES细胞中其他滋养层细胞因子如Eomes和Gata3也可以诱导滋养层细胞相关的基因表达2，19。这些因子在滋养层细胞成熟过程的晚期发挥作用，却与定位无关23，31，32。囊胚一旦形成，TE/ICM中的干细胞将启动某一基因程序维持两者间的相互制约作用，这使得干细胞的获得需要跨越囊胚期这一假设显得合理。而对ICM发育的深入了解则需基于对第二胚层的进一步了解，这将在下一节进行讨论。

第二胚层决定：ICM的细分

受精后第3天，囊胚中的ICM包含两种类型的细胞：外胚层(EPI)和原始内胚层(PE)。只有EPI发育成胚胎，而PE是一个胚层外系，它将发育成于卵黄囊(图1-1)33"315。PE胚层在刚着床后有两个重要的角色：其一是为胚胎提供营养；其二，它是一个信号中心，协助原肠胚的前后极性的形成37。TE胚层是一个来源于PE胚层的特殊的干细胞系。多能的干细胞系也被称为XEN细胞，已确认其来源于PE胚层38(图1-2)。此外，当过表达PE转录因子如Gata4和Gata6时，ES细胞可被诱导成PE状细胞39。然而Gata4/6在PE发育的后期发挥作用4

异质性和祖细胞分选受精后第4天，囊胚着床。在这个阶段，PE是ICM囊胚腔表面的一个独特的单细胞层。由此，最初的假设认为PE是在囊胚着床时期由直接面向囊胚腔的ICM细胞产生的，并推测在这个阶段面向囊胚腔的细胞和深层细胞之间的微环境的差异参与了胚层决定。然而，最近的研究表明，在着床的24小时前可以在囊胚腔检测到EPI祖细胞和PE祖细胞36，42，43。在这一阶段，ICM是一个EPI祖细胞和PE祖细胞的混合细胞群，并表达胚层特异性转录因子。在这个阶段之前，ICM中的所有细胞均表达Nanog和Gata6;在囊胚扩张过程中，Nanog和Gata6的表达逐渐出现相互排斥，从而以不依赖于位置的方式使两种祖细胞发生分化36，44。值得注意的是，在ICM中没有定型的模式决定两种祖细胞的分布，它们像盐和胡椒一样随机散布在整个ICM。

这些结果表明，着床后两种随机分布的胚层祖细胞形成两个形态不同的胚层。利用活体成像技术对表达荧光胚层标记的转基因小鼠中的囊泡扩张进行实时观察支持了这一理论模型。在PdgfraH2B-GFP小鼠的PE中表达了组蛋白H2B-GFP，这表明两个胚层的分离包