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免疫室自我鉴定总结篇1
1 材料和方法
1.1 材料
免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂购自Sigma公司; 羊抗鼠IgGHRP购自中山公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱购自Amersham公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜购自Amersham公司; ECL反应试剂盒购自Amersham公司; 半干转印仪购自BioRad公司; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备
成人肝组织匀浆700～750 r/min, 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min, 取上清, 10 000 g离心10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗2次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量(Mr)。
1.2.2 鼠抗人mAb的制备
将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次, 1周后经尾静脉取血, 分离血清, ELISA法测定效价。融合前3 d进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备mAb
。
1.2.3 抗原的鉴定
(1)抗原的质谱鉴定: 应用mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行SDSPAGE电泳, 根据Western blot结果显示的阳
性条带, 从SDSPAGE胶上切下相应的条带, 酶切, 质谱鉴定。(2)抗原的UniZAP XR表达文库筛选鉴定: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中, 37℃震荡培养至A600为0.7左右, 3 000 r/min下离心10 min, 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5, 取适当稀释的文库60 μL(含约50 000个噬菌体)与600 μL重悬的XL1BLUE MRF'混匀后37℃温育20 min, 铺至150 mm的NZYLB平板上, 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面, 37℃继续培养3.5 h, 用防水墨水定位后, 剥离滤膜, 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆, 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。
1.2.4 mAb的鉴定
(1)Western blot 分析: 线粒体总蛋白经SDSPAGE后, 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入1∶
2 000稀释的mAb, 室温下孵育2 h, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST缓冲液洗膜后, ECL法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片, PBST浸洗3 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL, 室温孵育15 min, 滴加H2O2甲醇, 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭20 min, 加入1∶100稀释的鼠抗人CPS1 mAb, 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。(3)免疫荧光染色: 取liver carcinoma cells (HCV)细胞, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化, 制成单细胞悬液, 将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养1～3 d, 待细胞接近长成单层, 加入适当稀释的罗丹明123, 置50 mL/L CO2, 37℃孵箱中培养30 min, 取出盖玻片, 浸入PBS（0.01 mol/L, pH7.4）,
免疫室自我鉴定总结篇2
具有临床意义的内源性和（或）外源性化合物的监测
内分泌激素和营养素的监测对个体的疾病诊断、预测和评价健康状态都是非常有帮助的。以维生素D及其代谢产物为例，国内外最新研究认为，维生素D与心血管疾病、代谢性疾病[5]和肿瘤等疾病的发生间具有一定相关性。目前，临床以检测25(OH)-D总量来表示维生素D状况，虽然25(OH)-D水平在体内波动小，相对而言，浓度较高易于测量，半减期较长(~3周)，但LC-MS检测法比放免法、酶免疫法等快速且灵敏，更耐用。1,25(OH)2-D3是维生素D状态最好的监测指标，但其在体内含量极低且不稳定，目前已开发出可用以检测1,25(OH)2-D3的LC-MS法，比放射免疫分析法有更高的特异度和灵敏度，且安全。另外，临床要求监测儿童体内极低量性激素变化情况，但免疫法检测低于试剂盒检测下限的数据波动很可能不能反映体内真实水平。质谱技术可为我们提供pg甚至是fg级的检测限，但需注意高分辨带来的高背景噪音问题，应综合考虑。
治疗药物监测
作为临床个体化治疗重要组成部分，对于一些血药浓度与疗效关系密切、有明确的有效浓度范围、治疗窗较窄、体内代谢个体差异大、药物中毒症状与疾病症状难以鉴别、用于长期治疗和抢救的药物等情况下，临床需测定体液中药物的浓度，指导临床个体化治疗，让患者利益最大化而风险最小化。美国病理学家学会研究表明，采用LC-MS法检测结果更具有真实性和实验可信度，已成为治疗药物监测必备的分析方法。目前，临床实验室仍以免疫分析为主要方法，质谱分析法由于自动化程度不足和缺少认证试剂在近期内难以取代前者，但依旧是实验室非常好的参考方法。
微生物鉴定
感染性疾病的病原学诊断仍以微生物的分离培养作为“金标准”，但能培养成功的仅为少数，且病原体（尤其是真菌）的培养周期较长，费用颇高，因此微生物非培养技术正是为满足难培养或者感染早期诊断需要所建立的方法，包括蛋白质组学、基因组学、宏基因组技术、DNA指纹技术、分子杂交及生物芯片技术等。此处介绍应用MALDIBiotyper高通量微生物鉴定系统，通过鉴定病原体自身独特的蛋白质组成，在MALDI-TOF质谱仪中得到指纹图。该系统另一个重要的组成部分是已包含3千多种微生物蛋白特征指纹图谱数据库，通过特征模式峰的匹配值作鉴定。质谱技术鉴定微生物的优点在于其操作简单（微生物单个菌落前处理简单）、快速且高通量（每1.5h可检测100个样本），灵敏度高（100ng蛋白即可检出），准确率高(<5u，m/z：~10000u)，成本经济（<1欧元），稳定性及重现性好（微生物蛋白指纹谱峰主要集中在2～20ku质量范围内，这些持续高表达的蛋白质受微生物生长环境和状态影响很小），以上优点使得质谱技术在病原体临床诊断方面具有广阔的应用前景。同时，我们也需要认识到质谱技术的限制性，虽然其在微生物检定中可快速、准确、早期地诊断感染性病原体，但仍不能替代药敏实验。合理、正确、综合地将有限的实验数据变为高效的诊断信息才是检验的目的，质谱技术的加入不仅没有妨碍反而极大程度地推进了检验医学的发展。
生物标志物研究
由于质谱技术的高灵敏度、高准确率及易于自动化等特点，毫无疑问地成为解决蛋白质组学关键手段之一，在生物标志物研究中是必不可少的一种手段。生物质谱技术在其中扮演了重要角色，其测定生物大分子的相对分子质量高达400ku，准确率高达0.100%～0.001%，远高于目前常规应用的十二烷基硫酸钠电泳和高效凝胶色谱技术。利用肽质量指纹谱技术，结合蛋白质数据库检索，可实现对蛋白质的快速鉴别和高通量筛选，寻找新的生物标志物。同时，利用生物质谱的准确相对分子质量测定，可实现对二硫键和自由巯基及蛋白质翻译后修饰如糖基化等的快速定位与确定，包括SNPs在内，生物质谱已实现对数十个碱基寡核苷酸的分子量和序列进行测定，应用浸入分裂法结合MALDI-TOF质谱可对基因组SNPs进行分析，该法既节省时间，又适于高通量分析，有利于特异性基因的定位、鉴定和功能表征。
免疫室自我鉴定总结篇3
医学免疫学的教学内容繁多，包括理论和实验两大块，主要从免疫系统、免疫细胞及免疫分子方面讲授免疫学的基本原理、生理和临床意义以及在临床疾病诊断、预防和治疗中的应用。近年来，免疫学的发展日新月异，新的发现和技术层出不穷，由曹雪涛主编的《医学免疫学》已更新至第7版，但在教学过程中仍存在不少问题：①教学内容陈旧，未能紧跟免疫学研究的前沿进展；②教学方式单一，仍是以教师为主体的课堂式教学；③医学免疫学实验教学普遍存在实验内容陈旧、实验操作过于简单、教学模式单一、学生积极性差等问题［3，4］。这在很大程度上限制了学生主观能动性的发挥，也无法培养学生分析和解决问题的能力。为提高医学免疫学的教学质量和教学效果，有学者提出在医学免疫学实验课中增加自主实验设计内容，开阔学生的科研思维［5，6］。这说明科研可促进医学免疫学的实验教学。此外，也有学者提出将科研融入医学免疫学的教学，以培养学生的科研思维和创新能力［7］。然而，如何通过科研反哺教学途径提高临床医学专业的医学免疫学教学，尚无具体的教学改革措施。因此，我们结合本教研室多年来的教学实践，从医学免疫学的理论和实验教学两方面对科研如何反哺教学进行改革和探索。
2科研反哺临床医学专业医学免疫学理论教学改革
医学免疫学是临床医学专业学生必修的基础专业课。我校医学免疫学有72个学时，包括56个理论学时和16个实验学时。本教研室一直很重视临床医学专业本科生的医学免疫学理论教学；在加强师资队伍培养的同时，定期开展教学讨论，研讨如何将科研反哺医学免疫学的理论教学。
2．1将医学免疫学的重大发现以科研故事方式应用于理论教学
医学免疫学的理论主要来源于科研实践。为提高临床医学专业学生的学习兴趣和积极性，将医学免疫学的重要知识来源以科研故事的方式呈现给学生是不错的方法。例如，在讲解胸腺是T淋巴细胞发育成熟的重要器官时，可向学生阐述其发现过程：1961年Miller和Good等发现小鼠新生期切除胸腺或新生儿先天性胸腺缺陷，其外周血和淋巴器官中淋巴细胞数量明显减少，致使免疫功能缺陷。由此确定T淋巴细胞的发育和成熟依赖于胸腺，T来自胸腺Thymus的第一个字母。通过这样的讲述，学生对T细胞的发现及胸腺的作用就有了较好的认识。在讲解补体一章时，可向学生介绍1895年JulesBordet如何开拓了补体学领域以及1899年Ehrlich对补体的命名（存在于正常血清中、对热敏感的成分是抗体发挥溶菌或溶细胞作用所必需的补充条件）。听完这些研究发现后，学生对补体的理化性质及功能会有初步的认识，进而对补体成分和复杂的补体激活途径产生兴趣。因此，以科研故事的方式讲解医学免疫学理论知识是科研反哺教学的重要途径。此外，通过讲解免疫学重要知识的发现过程，能让学生熟悉书本知识的来龙去脉，了解科学研究的基本方法，有利于培养学生的科研思维。
2．2教师的科研反哺医学免疫学理论教学
本教研室教师均具有自己的科研方向，这为科研反哺教学提供了重要的前提条件。在医学免疫学理论教学过程中，教师结合自己的科研能极大地提升教学效果。例如，在讲解细胞因子的功能时，可向学生介绍在科研过程中，研究者经常在体外加入某种或某些细胞因子促进免疫细胞的分化成熟，如利用GM－CSF可促进骨髓细胞向粒细胞增殖和分化；用TGF－β可促进naveT细胞向调节性T细胞（Treg）分化。在讲解白细胞分化抗原和分化群（clusterofdifferentiation，CD）时，教师可根据自己的研究方向，结合流式细胞术说明CD分子在科研中的重要作用，加深学生对白细胞分化抗原及CD分子概念的理解。此外，教师可将最新的研究进展与教材中的知识结合起来，开阔学生的视野，激发学生的求知欲。因此，将教师的科研融入医学免疫学的理论教学能很好地提高临床医学专业的教学质量。
2．3采用PBL教学使科研反哺医学免疫学理论教学
医学免疫学理论教学的效果有赖于良好的教学方法［8］。除了课前制作精美的PPT课件外，我们主要采用PBL（problem－basedlearning）教学使科研反哺医学免疫学理论教学。一方面，鼓励学生积极思考；另一方面，激发学生的学习动力和兴趣。此外，本教研室教师会选择一些高质量的综述或重要研究文献，布置1－2个问题，让学生根据提供的题目去查阅相关文献，获得教学内容相关的知识。采用PBL教学能很好提高学生的自主学习能力和科研思维能力。
3科研反哺临床医学专业医学免疫学实验教学改革
医学免疫学实验教学是理论联系实际的纽带，是医学免疫学课程的重要组成部分，不仅可加强学生对医学免疫学理论知识的理解和记忆，同时还可培养学生的科研思维能力和实践操作能力［9］。为提高临床医学专业学生医学免疫学的实验教学，本教研室在2010年组织编写了全国高等医学院校实验教学规划教材《医学免疫学实验》，并在2016年做了修订。现阶段，我校医学免疫学的实验教学开设了凝集沉淀反应（ABO血型的鉴定）、免疫标记技术（ELISA法检测乙肝“两对半”）、天然免疫功能检测（中性粒细胞的小吞噬实验、溶菌酶的溶菌作用、溶血反应等）和细胞免疫功能的检测（PBMC的分离和E花环实验、流式细胞术、淋巴细胞的转化实验等）等医学免疫学实验。这些经典的免疫学实验不仅能加深学生对理论知识的理解，也能培养学生分析和解决问题的能力。为进一步提高实验教学的效果，我们从科研反哺教学角度进行了如下教学改革探索。
3．1采用科研思维进行医学免疫学实验教学
首先，在临床医学专业学生进行实验前，向学生介绍实验的基本原理、实验目的、方法、步骤以及注意事项。在此阶段通过多问“为什么”，鼓励学生积极思考。然后，由指导老师引导学生进行实验，同时要求学生详细记录实验过程中所遇到的问题，对自己的实验结果进行分析并给出相应的结论。最后，由指导老师进行评价和总结，要求学生撰写较为详细的实验报告。在实验报告中，需要学生以科学研究的方式呈现实验结果、结果分析、实验结论及改进措施。通过鼓励学生思考实验现象背后的原理和实验失败的原因，能够激发学生的学习热情，提高学生对理论知识的认识，并能锻炼学生的科研思维能力。
3．2指导学生进行实验设计和开展研究课题
免疫室自我鉴定总结篇4
【关键词】 ALDH8A1; 重组蛋白; 多克隆抗体
ALDH8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1）的基因定位于人类染色体6q23.2， 编码487个氨基酸， 又名ALDH12。ALDH8A1是一个细胞溶质酶， 在体内9顺式视黄酸的生物合成途径中具有重要作用。与全反式视黄醛相比， ALDH8A1是第一个已知的更偏向于9顺式视黄醛结合的醛脱氢酶［1， 2］， 它能够将9顺式视黄醛氧化为9顺式视黄酸。9顺式视黄酸生物学活性较强， 可通过核维甲酸受体（RAR）结合于DNA应答元件调节靶基因的转录; 尚能与维甲酸X受体（RXR）结合， 在调控细胞生长、 分化、 凋亡等生命活动中起重要作用。ALDH8A1在非酒精性脂肪肝（NASH）患者中呈上调表达， 这可能与其在能量和代谢途径中的氧化作用相关［3， 4］。我们通过原核表达系统重组表达ALDH8A1蛋白， 免疫家兔， 获得了抗ALDH8A1的多克隆抗体（pAb）， 并进行抗体特异性鉴定， 及ALDH8A1在组织和细胞内的定位。
1 材料和方法
1.1 材料 成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。大肠杆菌DH5α和BL21菌株为本实验室保存。pGEX4T1和pET32a载体购自Novagen公司。DNA聚合酶Ex Taq， 限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ， T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒， 质粒提取试剂盒购自Omega公司。IPTG诱导剂购自Merck公司。雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。弗式佐剂购自Sigma公司。PVDF膜购自Amersham公司。HRP羊抗兔IgG、 poly Helper购自北京中杉金桥公司。ECL反应试剂盒购自Amersham公司。
1.2 方法
1.2.1 ALDH8A1重组蛋白的表达、 纯化及鉴定 根据Human Protein Reference Database提供的ALDH8A1的氨基酸序列， 应用生物信息学软件DNAstar进行抗原表位分析后， 选取27119 aa片段进行引物设计并重组表达。片段全长279个核苷酸， 在其上游引物设计EcoRⅠ酶切位点， 下游引物设计XhoⅠ酶切位点， 用成人肝cDNA文库为模板进行PCR扩增， 琼脂糖凝胶电泳并回收扩增的目的片段。回收片段及pGEX4T1和pET32a载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后， 以适当比例将目的片段分别与两个载体连接并转化大肠杆菌DH5α， 阳性克隆经测序证明插入片段序列正确后抽提质粒， 转化大肠杆菌BL21， 诱导表达GSTALDH8A1和HisALDH8A1蛋白并纯化。将纯化的蛋白经SDSPAGE后， 电转移至PVDF膜上。封闭过夜， 加入兔抗GST标签多抗室温孵育1 h， 加入HRP羊抗兔IgG， 室温孵育45 min， ECL显色， 于暗室曝光显影， 用以检测目的蛋白。
1.2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的制备 将重组GSTALDH8A1蛋白以生理盐水稀释， 与等体积弗氏完全佐剂充分混匀并乳化后， 每只家兔皮下多点注射800 μg; 4周后第2次免疫400 μg（后不完全佐剂）; 4周后加强免疫800 μg; 1周后颈动脉放血， 于37℃放置2 h， 4℃沉淀过夜后， 离心分离血清， 分装后置-20℃保存。
1.2.3 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）ELISA检测ALDH8A1抗血清效价: 检测板用HisALDH8A1融合蛋白（1 mg/L）包被， 每孔100 μL， 4℃过夜。每孔加入200 μL封闭液， 37℃封闭2 h。每孔加入100 μL以1∶4梯度稀释的抗血清（阴性对照为正常兔血清， 空白对照为封闭液）， 37℃孵育30 min。加入HRP羊抗兔IgG， 37℃孵育30 min。TMB显色后， 酶标仪450 nm处读值。（2）Western blot检测兔抗人ALDH8A1 pAb与重组蛋白和天然蛋白的反应特异性: 将重组HisALDH8A1蛋白、 成人肝匀浆总蛋白及多种肿瘤细胞总蛋白经SDSPAGE后， 电转移至PVDF膜上。封闭过夜后， 加入兔抗人ALDH8A1 pAb， 以正常兔血清作为阴性对照， 室温孵育1 h， 加入HRP羊抗兔IgG， 室温孵育45 min后， ECL显色， 于暗室曝光显影。（3）免疫组化鉴定: 将人肝癌组织石蜡切片脱蜡后， 滴加30 mL/L H2O2处理10 min。在抗原修复盒内以0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液保持92℃～98℃， 持续15 min。滴加正常羊血清37℃封闭30 min， 加入ALDH8A1兔多抗， 4℃孵育过夜。滴加poly Helper， 37℃孵育30 min， 增加组织通透性。加入HRP羊抗兔IgG， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 封片。
2 结果
2.1 ALDH8A1重组融合蛋白的表达、 纯化及鉴定 经PCR扩增得到了ALDH8A1目的片段， 分别构建GSTALDH8A1和HisALDH8A1质粒， 并转化大肠杆菌BL21。经 IPTG诱导后， 分别表达出包涵体形式的重组GSTALDH8A1和可溶性形式的重组HisALDH8A1蛋白， 其Mr分别为36 000和29 000， 与预测的ALDH8A1融合蛋白Mr相一致， 经纯化后蛋白纯度均高于80%。通过Western blot鉴定， 重组GSTALDH8A1蛋白可被抗GST标签的抗体识别， 重组HisALDH8A1蛋白可被抗His标签的抗体识别（图1）。
图1 ALDH8A1融合蛋白的Western blot分析（略）
1: GSTALDH8A1融合蛋白; 2: HisALDH8A1融合蛋白.
2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）用重组HisALDH8A1蛋白包被检测板， ELISA检测兔抗人ALDH8A1血清的效价为1: 256 000。（2）Western blot结果表明， 兔抗ALDH8A1血清与BL21空菌对照（图2， 泳道1）无反应; 与重组HisALDH8A1蛋白（图2， 泳道2）及GST标签蛋白（图2， 泳道3）有反应， 所识别条带的Mr分别为29 000与26 000， 证明兔抗血清中包含了抗目的蛋白ALDH8A1及标签蛋白GST的抗体。另外， 兔抗血清可以识别正常成人肝总蛋白中Mr为53 000的蛋白（图2， 泳道5）， 这与文献报道的ALDH8A1天然蛋白Mr一致。以293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞系总蛋白作为抗原， ALDH8A1抗血清作为一抗进行Western blot检测， 结果显示， 在53 000处均有明显条带， 证明ALDH8A1兔多抗能够识别多种肿瘤细胞系中的ALDH8A1天然蛋白（图3）。（3）免疫组化结果表明， 以人肝癌组织切片进行检测， 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体识别的抗原定位于肝癌细胞胞质内（图4）。
图2 兔抗人ALDH8A1抗血清的Western blot分析（略）
1: E.coli BL21对照; 2: HisALDH8A1融合蛋白; 3: GST蛋白; 4: 成人肝脏总蛋白; 5: 成人肝脏总蛋白．
图3 用Western blot分析兔抗人ALDH8A1血清对不同肿瘤细胞蛋白的识别（略）
1: 293T细胞裂解蛋白; 2: A549细胞裂解蛋白; 3: HeLa细胞裂解蛋白; 4: U937细胞裂解蛋白; 5: HepG2细胞裂解蛋白．
图4 免疫组化检测ALDH8A1在肝癌组织中的表达（略）
A: 人肝脏正常组织; B: 人肝脏癌变组织．
3 讨论
ALDH8A1蛋白的Mr约为53 000， 含有487个氨基酸， 含有23个不变氨基酸和4个保守区域， 以及ALDH家族具有代表性的半胱氨酸残基。该蛋白在成人肝及胎肝、 肾脏中表达量较高， 这可能与9顺视黄醇高度集中在这两个器官有关［5］。近年来， 有报道指出， 9顺视黄酸能够诱导肿瘤细胞凋亡， 而ALDH8A1则是9顺视黄醇转化为9顺视黄酸最为关键的酶， 调节了视黄醇的分配， 并维持着机体视黄醇的平衡。在已知的维甲酸类化合物中， 只有9顺视黄酸既能与核维甲酸受体又能与核维甲酸X受体结合发挥其生物学效应， 从而影响细胞DNA的合成， 改变细胞周期和信号传导途径， 还可以影响某些癌基因及细胞因子基因的表达。
本研究中， 我们通过抗原表位分析， 选取了ALDH8A1的27119aa， 以原核表达系统重组表达了GSTALDH8A1和HisALDH8A1融合蛋白， 并以GSTALDH8A1为免疫原， 以HisALDH8A1为检测原， 成功制备了兔抗人ALDH8A1多克隆抗体。对其进行特异性鉴定， 结果表明兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够特异地识别重组表达的ALDH8A1蛋白， 并能够特异地识别成人肝总蛋白中以及多种肿瘤细胞蛋白中的ALDH8A1天然蛋白。免疫组化结果显示兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够与人肝癌组织呈阳性反应。所制备的兔抗人ALDH8A1多克隆抗体对ALDH8A1具有很好的特异性识别， 可应用于ELISA、 Western blot及免疫组化的检测。该抗体的获得可为进一步研究 ALDH8A1在NASH等多种代谢疾病的发生、 发展过程中确切的分子机制提供必要的工具。
参考文献
［1］ Jiang J， Best S， Menzel S. cMYB is involved in the regulation of fetal hemoglobin production in adults［J］. Blood， 2006， 108(3): 1077-1083.
［2］ Lin M， Napoli JL. cDNA cloning and expression of a human Aldehyde dehydrogenase (ALDH) active with 9cisretinal and identification of a rat ortholog ALDH12［J］. J Biol Chem， 2000， 275(51): 40106-40112.
免疫室自我鉴定总结篇5
1 材料和方法
1.1 材料 大肠杆菌DH5α及BL21(DE3)菌株为本实验室保存。pGEX4T1表达载体购于GE公司， pET32a表达载体购于Novagen公司。PCR回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购于Omega公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购于PIERCE公司。ExTaq酶、 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购于日本TaKaRa公司。弗氏完全佐剂及不完全佐剂购于Sigma公司。PVDF膜、 ECL反应试剂盒购于Amersham公司。羊抗兔IgGHRP， FITC羊抗兔IgG、 Hochest染核试剂、 羊血清封闭液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。扩增PON2部分片段的特异性引物由北京英骏生物公司合成。其上游引物序列为: 5′CGGGATCCATGACAGTCAAACATGAGCTTCTTCCAAG3′， 下游引物序列为: 5′CCGCTCGAGTTAGAGTTCACAATACAAGGCTC3′， 下划线部分为BamH I和Xho I的酶切位点。免疫用新西兰大耳白兔（雌性， 2 kg， 120 d）由军事医学科学院实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化 搜索PON2的蛋白序列(Human Protein Reference Database， hprd.org)， 应用 DNAstar分析软件分析其亲水性， 疏水性及可能的抗原表位， 利用美国国立数据库（ncbi）的blast功能进行不同种属蛋白的同源性分析。选取同源性得分较低， 亲水性及免疫原性得分较高的片段进行重组表达。PCR扩增所用模板为PON2的cDNA (由北京蛋白质组研究中心蛋白相互作用实验室惠赠)， PCR产物经回收后， 直接用BamH I和Xho I双酶切， 酶切产物分别与表达载体 pGEX4T1 和 pET32a连接， 连接产物转化至感受态DH5α中， 涂板后37℃培养过夜， 次日挑取单克隆， 接种于含（0.1 g/L）氨苄西林的LB培养液中， 37℃震荡培养至A值约为0.3， 用10 μL PCR体系进行阳性克隆的鉴定， PCR鉴定阳性的克隆进行测序。测序正确后抽提pGEX4T1PON2 和 pET32aPON2质粒， 并转化入E.coli BL21（DE3）进行IPTG诱导表达。pGEX4T1PON2 和 pET32aPON2质粒在E.coli BL21（DE3）中均为包涵体表达， 菌体经超声波破碎后， 采用常规包涵体纯化法纯化， 纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素中， BCA法及SDSPAGE法进行蛋白的定量及纯度分析。
1.2.2 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析 将重组菌菌体蛋白经SDSPAGE凝胶电泳后， 点转移至PVDF膜上。经50 g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h后， 加入1∶2 000稀释的鼠抗GST mAb， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入HRP羊抗鼠IgG（1∶5 000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显影。
1.2.3 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 取1.6 mg 纯化的GSTPON2重组蛋白溶于1 mL生理盐水中， 并与等体积福氏完全佐剂混合进行充分乳化， 取2只新西兰大耳白兔进行背部及腹股沟皮下多点注射， 每只兔子免疫1 mL抗原及佐剂混合物， 4周后蛋白剂量减半进行第2次免疫， 4周后进行第3次免疫， 免疫剂量为800 μg/只， 第3次加强免疫后10 d进行颈动脉取血， 分离血清。获得后的血清用HisPON2重组蛋白进行特异性的监测。
1.2.4 抗血清的纯化 兔血清用60 mmol/L的醋酸钠缓冲液稀释3～4倍， 0.1 mol/L NaOH调PH至4.5。缓慢滴加辛酸至浓度为25 mL/L， 温柔搅拌30 min后， 4℃， 10 000 g离心30 min， 弃沉淀， 上清用滤纸过滤后加入1/10体积10×PBS缓冲液， 调pH至7.4， 在搅拌条件下缓慢加入预冷的饱和硫酸铵溶液至45%的饱和度， 4℃沉淀过夜。次日于4℃、 3 000 g离心30 min， 弃上清， 用1×PBS缓冲液溶解沉淀。得到的溶液即为纯化的抗体， 对1×PBS缓冲液透析过夜。透析后抗体用SDSPAGE法检测纯度， BCA蛋白浓度测定试剂盒进行抗体的定量分析。
1.2.5 多克隆抗体的鉴定 （1）Western blot分析: 取正常人肝组织匀浆， 用RIPA 裂解液（10 mL/L NP40， 150 mmol/L NaCl， PBS pH7.2， 2 mmol/L， EDTA， 50 mmol/L 氟化钠， 0.2 mmol/L钒酸钠， 蛋白酶抑制剂1∶50）裂解。冰上孵育30 min 后， 13 500 g 离心45 min， 获得正常人肝组织裂解液。HeLa细胞及U937细胞待细胞密度达到约2×107时， 用上述方法处理获得细胞裂解液。上述3种蛋白各取24 μg加入等体积的2×SDS加样缓冲液， 100℃加热15 min， 进行常规SDSPAGE 电泳， 电泳后， 蛋白转移至PVDF膜上， 用50 g/L脱脂奶粉封闭后; 加入50 mg/L纯化的GSTPON2多抗， 室温下孵育1 h， TBST 洗膜后， 加入1∶20 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG， 室温孵育1 h， TBST 缓冲液洗膜后， ECL法显影分析。（2）间接细胞免疫荧光分析: 于6孔板中放入灭菌载玻片， 每孔接种1×105的SY5Y细胞（神经母细胞瘤细胞）， 待细胞爬片后培养48 h， 40 g/L 多聚甲醛（10 mL/L Triton）固定10 min; 空气干燥5 min; PBS 清洗标本3次， 各2 min; 羊血清（用1×PBS 按1∶10稀释）37℃ 封闭30 min; 加入30 mg/L纯化的多抗作为一抗， 4℃孵育过夜; 次日PBS清洗标本3次， 吹干; 滴加1∶200稀释的 FITC羊抗兔 IgG， 室温孵育30 min; PBS 洗3次; 滴加Hochest染核试剂（用1×PBS 按1∶5 000稀释）， 室温孵育30 min， PBS 洗3次; 800 mL/L 甘油封片， 镜检拍照。
2 结果
2.1 PON2重组蛋白的原核表达及纯化
2.1.1 PON2的生物信息学分析 为了有效获得高效价， 高特异性的多克隆抗体， 我们对PON2全长蛋白序列与家兔的PON2蛋白进行了同源性分析， 结果发现靠近C端的片段与兔的同源性较低。我们又用DNAstar软件对蛋白的亲水性及可能的抗原表位进行了分析， 根据亲水性、 免疫原性、 灵活性及柔韧性及同源性等的分析， 最后选取157354位氨基酸进行下一步的克隆表达。
2.1.2 PON2基因的PCR扩增 用PON2 cDNA作为模板扩增目的片段， 结果见图1， 在594 bp处有1条特异的扩增条带， 片段大小与预期值一致， 表明PCR特异性好， 扩增成功。将扩增后目的片段分别连接入pGEX4T1 和 pET32a 载体， 并转化入DH5α中， 菌液PCR鉴定结果显示插入片段大小与目的片段大小相符， 表明PON2目的片段已插入至载体中。挑取PCR阳性克隆进行测序， 测序结果与PON2基因序列进行比对。比对结果显示获得的片段与PON2基因序列有99%的一致性， 其中的半胱氨酸突变成酪氨酸， 两者同属极性中性氨基酸， 对抗体的制备不会产生影响。
图1 PON2基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）
Fig 1 Agarose gel electrophoresis analysis of PON2 by PCR
M: DNA marker; 1: PCR product of PON2.
2.1.3 PON2重组蛋白的表达与纯化 从阳性克隆中提取质粒， 转化入BL21(DE3)大肠杆菌中， 进行IPTG诱导表达， 结果见图2， 与BL21空菌对照相比， 目的克隆中有明显蛋白表达， 带GST标签的重组蛋白理论相对分子质量(Mr)应为46 000， 与图2中条带3显示的Mr相符。带His标签的重组蛋白理论Mr应为40 000， 与图2中条带4显示的Mr也相符， 因此我们成功获得了带GST标签及His标签的PON2重组表达载体。由于载体中GST标签来自寄生虫的序列， 从而使重组蛋白具有更高的免疫原性， 因此我们选择带GST标签的蛋白进行免疫， 带His标签的蛋白用于抗体检测。图中结果显示， 融合蛋白主要以包涵体的形式表达， 重组蛋白的纯度均在90%以上， 浓度为4 g/L以上， 适合用于免疫。通过Western blot检测， 应用抗GST 的抗体能够在相应位置检测到GSTPON2融合蛋白， 结果见图3。
图2 PON2重组蛋白SDSPAGE分析（略）
Fig 2 SDSPAGE analysis of PON2 fusion protein
1: Protein marker; 2: BL21 E.coli control; 3: GSTPON2 fusion protein (46 000); 4: HisPON2 fusion protein (40 000).
图3 GSTPON2融合蛋白的Western blot分析（略）
Fig 3 Western blot analysis of GSTPON2 fusion protein using antibody against GST
1: Null PGEX4T1 vector expressed in E.coli BL21 as control; 2: GSTPON2 fusion protein expressed in E.coli BL21.
2.2 兔抗人GSTPON2多克隆抗体的制备 将上述获得的GSTPON2重组蛋白经3次动物免疫后收集兔抗血清， 并在第1次加强免疫后进行Western blot检测特异性， 结果如图4， 用His标签的重组蛋白作为检测抗原， 与阴性对照比较（BL21菌体总蛋白）， 在相应位置有一特异性结合抗体的条带， Mr为40 000， 与HisPON2重组蛋白Mr一致。用免疫前正常兔血清与HisPON2重组蛋白杂交， 发现正常兔血清与HisPON2蛋白无反应， 这些结果说明此抗体与E.coli BL21空菌无反应而只与PON2目的片段有特异反应， 以上结果说明此次免疫是成功的。
图4 兔抗GSTPON2抗血清特异的Western blot分析（略）
Fig 4 Western blot analysis of specificity of rabbit antiserum against GSTPON2
1: BL21 E.coli control (primary antibody: normal rabbit serum); 2: HisPON2 fusion protein (primary antibody: normal rabbit serum); 3: BL21 E.coli control (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2); 4: HisPON2 fusion protein (primary antibody: rabbit antiserum against GSTPON2).
2.3 抗血清的纯化 三次免疫后取兔血清进行辛酸硫酸铵法纯化多抗， 纯化抗体纯度经SDSPAGE电泳鉴定， 结果见图5。Mr约55 000处为抗体重链， 25 000处为抗体轻链， 由于纯化抗体为多抗， 所以在25 000处呈弥散状， 从图中可以看出， 纯化后抗体纯度在95%以上。
图5 抗GSTPON2多克隆抗体的纯化（略）
Fig 5 Purification of polyclonal antibody against GSTPON2
1: Protein marker; 2: GSTPON2 pAb.
2.4 多克隆抗体的鉴定
2.4.1 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的Western blot分析 文献报道， PON2在很多组织中广泛表达， 因此我们分别选择了人肝脏组织、 HeLa细胞系、 U937细胞系作为研究对象， 将组织和细胞裂解后获取裂解蛋白作为电泳样本， 用纯化的兔抗人GSTPON2的多克隆抗体进行Western blot分析（图6）。结果发现兔抗人GSTPON2重组蛋白的多抗均可特异识别肝脏组织、 HeLa细胞、 U937细胞中Mr约为39 000 的蛋白， 而PON2的天然蛋白Mr 39 398。说明制备的PON2多克隆抗体能结合天然PON2蛋白。
2.4.2 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析 由GeneCards数据库可知PON2在脑组织中有高表达， 用SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）进行多克隆抗体的间接免疫荧光分析， 结果见图7。PON2蛋白在细胞质膜上表达， 在间接免疫荧光试验中固定细胞时加用10 mL/L Triton X100进行通透化处理， 故胞质内亦明显的阳性着色。为进一步研究PON2的细胞定位奠定基础。
图6 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体对不同组织蛋白Western blot分析（略）
Fig 6 Western blot analysis of rabbit polyclonal antibody against PON2
1: Human liver tissue lysate; 2: U937 cell lysate; 3: HeLa cell lysate.
图7 兔抗人PON2蛋白多克隆抗体的间接免疫荧光分析（略）
Fig 7 Indirect immunofluorescence analysis of rabbit polyclonal antibody against human PON2 protein
A， B， C: pAb against PON2(30 mg/L); D， E， F: Normal rabbit serum (1∶1 000).
3 讨论
Sergei等［6］报道PON蛋白作为Numb蛋白的伴侣参与细胞的不对称分裂过程中。细胞不对称分裂是由一个母细胞发育成二个不同的细胞， 在许多的发育进程中是非常重要的。细胞不对称分裂是通过祖细胞局限的决定子作用来实现的。在果蝇有丝分裂中， 神经命运决定子Prospero和Numb分别通过Miranda和PON定位于细胞基底区， 这些决定子与Inscutable和Bazooka的顶端定位一起控制纺锤体的方向， 以保证祖细胞分裂成顶端的成神经细胞和基底区的神经节母细胞。PON蛋白作为细胞不对称分裂中一个决定子发挥重要的作用。
PON2作为PON基因中的其中一个成员， 以前的研究证明PON2多态性与家族性高胆固醇血症、 糖尿病等有关。但PON2作为细胞不对称分裂的决定子却鲜有研究。目前尚无抗PON2的商业化特异抗体， 这使得研究PON2功能的工作举步维艰。本实验以此为切入点， 制备了兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体。本研究采用原核表达技术， 表达了GSTPON2和HisPON2融合蛋白， 并以GSTPON2为免疫原， 以HisPON2为检测原（提高检测的精确度）， 免疫动物成功制备了抗PON2抗血清。应用Western blot方法证明抗血清对PON2具有很好的识别特性， 应用间接免疫荧光染色检测细胞中表达的PON2， 其主要定位于细胞质中。研究PON2在细胞不对称分裂中的作用， 其重要问题是研究PON2与其他细胞不对称分裂决定子的在细胞分裂时的共定位问题， 以及PON2能否有PON蛋白作为Numb伴侣的作用。上述兔抗人PON2蛋白的多克隆抗体将为今后PON2分子的功能研究提供必要的工具。相应的单克隆抗体的制备实验已在进行中。
参考文献
［1］ Dragomir ID， John FT， Audrey S， et al. Human paraoxonases (PON1， PON2， and PON3) are lactonases with overlapping and distinct substrate specificities［J］. J Lipid Res， 2005， 46(6): 1239-1247.
［2］ Mira R， Tony H， Khetam H， et al. Decreased macrophage paraoxonase 2 expression in patients with hypercholesterolemia is the result of their increased cellular cholesterol［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2004， 24(1): 175-180.
［3］ Carey JN， Noam B， Victor G， et al. Paraoxonase2 deficiency aggravates atherosclerosis in mice despite lower apolipoproteinBcontaining lipoproteins［J］. J Bio Chem， 2006， 281(40): 29491-29500.
免疫室自我鉴定总结篇6
胸腹腔积液是常见的临床征象，病因复杂. 对积液进行脱落细胞学检查，可以判定疾病的性质，但普通染色片有时对高分化腺癌和增生性间皮细胞不易鉴别. 应用免疫细胞化学对积液中脱落细胞进行标记，并结合细胞形态学定量分析，在二者鉴别诊断中有较高的应用价值［1-2］. 我们对我院近年来良恶性胸腹水各30例采用免疫细胞化学SP法标记和计算机形态学定量分析，探讨免疫细胞化学和形态学观察在胸腹腔积液细胞学诊断和鉴别诊断中的意义.
1材料和方法
1.1材料
良性组(A组)30例，其中18例结核性胸水，胸部CT检查诊断为结核，痰中结核杆菌阳性;12例肝硬化腹水，腹部B超诊断为肝硬化，肝功谷草转氨酶升高，乙肝系列表面抗原阳性.男15例，女15例，年龄18~71（平均45.4）岁.恶性组(B组)30例，其中15例血性胸水，支气管镜或胸膜活检病理证实为肺腺癌;15例腹水，胃镜或B超诊断为胃癌或卵巢癌.男21例，女9例，年龄39~79（平均59.7）岁.
1.2方法
新鲜胸腹水沉淀5 min后，留取沉淀部分约10 mL，在自动涂片离心机(日本樱花精密机械有限公司产品)离心10 min (2100 r/min)，弃上清液，将沉淀在载玻片上的细胞均匀涂在常规HE染色的玻片，每例一张，在抹有APES载玻片上涂片，每例3张，稍干后，一张常规涂片放入950 mL/L乙醇中固定15 min，HE染色. 对其所示细胞在CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航天大学图像中心与空军总医院图像开发组产品，CMIAS型，WINDOW98软件)下测细胞核、浆的面积，核浆比例，细胞周长，平均直径，圆度，形状因子.置于40倍镜下观察，选择细胞密集重叠较少的区域采图，分割，编辑，统计，获得脱落细胞形态学原始数据. 对重叠细胞、红细胞或淋巴细胞予以弃除. 在同一制片、同种染色及光照条件下，每例测定分析细胞50个，校正因子1.1. 抹有APES的涂片稍干后，即放入乙醚乙醇液(1∶1)中固定15 min，水洗. 固定后的涂片先用蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗3次后，滴加A液(50 mL/L正常羊血清)适量，在室温、湿盒内各封闭10 min，37℃孵育1 h，PBS冲洗，每次5 min，再依次滴加BC液(二抗及SP液)，室温放置30 min. 免疫细胞化学染色采用SP法，一抗及其工作浓度分别为CEA(1∶350)，EMA (1∶150)，vimentin(1∶40)(均购自北京中山生物技术公司). PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性胸腹水涂片作阳性对照. 结果按照每张涂片的阳性细胞比例及着色深浅计分进行判定分析. 阳性细胞所占比例判断，无着色0分，1/3以下着色为1分，1/3~2/3为2分，2/3以上为3分. 阳性强度，无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 2项相乘0分为-，1~3分为+，4~6分为2+，7~9分为3+；将-视为阴性、+视为弱阳性、2+视为阳性、3+视为强阳性.
统计学处理：数据用x±s表示，计数资料组间比较采用χ2检验，计量组间比较采用t检验，所有统计学分析均用SPSS8.0软件完成.
2结果
A组涂片中以增生性间皮细胞和淋巴细胞为主，间皮细胞单个散在或成片排列，大小略不一致，细胞核呈圆或卵圆形、多居中，核膜清楚，染色质匀细，有小核仁，胞质丰富，淡伊红色. B组涂片，癌细胞呈团、腺样、乳头样或散在（图1），细胞大小不一，互相拥挤，核大，大小形状不一致，核膜厚，染色质粗且分布不均匀，核仁明显，胞质较少，内可见空泡. 可有病理性核分裂像. 免疫细胞化学染色结果A，B两组有差别（图2，3，表1）， A，B两组细胞形态学定量分析测定结果也有差别（表2）.表1良性和恶性两组免疫细胞化学SP法阳性表达（略）表2良性和恶性两组细胞形态学定量分析(略)
3讨论
癌胚抗原（CEA）是一组酸性糖蛋白. 广泛存在于各种上皮源性肿瘤，尤其是各种腺癌细胞中表达阳性，体腔间皮细胞中不含CEA，因而是鉴别腺癌和增生性间皮细胞的重要生物学标记物［3-4］. 上皮膜抗原（EMA）在腺癌中呈阳性表达，间皮细胞呈弱阳性可配合其他指标鉴别诊断. 波形蛋白（vimentin）是间叶源性肿瘤标记物，绝大多数上皮源性肿瘤为阴性表达，间皮细胞为阳性. 因而可区分腺癌与增生性间皮细胞. 我们的实验结果与文献报告一致［5］. 说明选用一组组织特异性抗体进行免疫细胞化学表达，在胸腹水中腺癌细胞和增生性间皮细胞鉴别诊断方面有重要作用. 新近研究认为［6］，CEA蛋白在胸腹水鉴别诊断的价值有差异，对良、恶性胸水鉴别有重要价值，而对良、恶性腹水鉴别价值较低. 其中原因可能有：①恶性腹水多由肝癌、卵巢癌等引起，而CEA在这些肿瘤中表达较低. ②部分恶性腹水是因静脉或淋巴回流受阻以及肿瘤而引起的低蛋白血症，而无肿瘤细胞浸润腹腔. 本文B组15例恶性胸水和15例恶性腹水中癌细胞对CEA表达均为阳性，其阳性率高于文献报道［5-6］，可能因观察例数较少. vimentin在间皮细胞中表达率较低，可能与离心等对细胞质影响有关. EMA在腺癌中呈阳性表达，而间皮细胞则为弱阳性，因此，免疫细胞化学用于良、恶性胸腹水的鉴别诊断，提高了阳性诊断率.
传统细胞学诊断主要依据细胞的大小、形态、结构、细胞的产物（如粘液）等. 恶性细胞有细胞核的改变（如核增大、深染、核浆比失调，染色质分布不均匀等），细胞互相拥挤等. 有一定的主观性. 信息技术的发展为细胞学诊断的数字化客观评价提供了可能. 本研究以胸腹水中脱落细胞为对象，定量测定其中细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子，发现恶性胸腹水中腺癌细胞明显高于良性胸腹水中的增生性间皮细胞，具有统计学意义(P0.05)，可能与图像预处理(如分割等)，灰度等原因有关.由于高分化腺癌与增生性间皮细胞的形态学参数阈值缺乏统一标准，尚待进一步研究，因此，图像分析对良恶性胸腹水的鉴别仅提供参考，仍需结合光镜下细胞的形态特点和免疫细胞化学结果. 总之，免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要价值，形态学定量分析可提供参考，二者综合分析对鉴别腺癌和增生性间皮细胞具有重要作用，是提高胸腹水阳性诊断率的有效途径之一.
【参考文献】
［1］Gong Y， Sun X， Michael CW， et al.Immunocytochemistry of serous effusion speeimens: A comparison of Thinprep vs cell block［J］.Diagn Cytopathol，2003，28(1):1-5.
［2］徐炜. 形态学定量分析在胸腔积液诊断中的应用价值［J］.诊断病理学杂志，2002，9(5):311-312.
［3］免疫组织化学方法在良恶性胸腹水鉴别诊断中的意义［J］. 实用医学杂志，2004，4(20):374-375.
免疫室自我鉴定总结篇7
Toll样受体作为细胞表面的模式识别受体， 能够对病原体识别、 结合、 引发一系列信号间的转导， 促进各种炎性介质的释放， 对宿主的天然免疫防御具有重要作用， 目前其家族成员至少有11个［1］。TLR与天然免疫应答关系的研究中， 倍受关注的是TLR2和TLR4。其中TLR2识别的配体最多， 可协助TLR4参与人体内对LPS的反应。在TLR2的结构中其胞外区富含亮氨酸的重复序列， 是配体作用的关键功能区域。我们应用RTPCR方法从人外周血单个核细胞中克隆TLR2胞外区基因， 并利用原核表达体系表达该基因的融合蛋白， 制备多克隆抗体并检测其活性， 为进一步研究TLR2胞外区的功能奠定必要的基础。
1 材料和方法
1.1 材料 淋巴细胞分离液购自天津TBD公司， Tripure购自Roche公司;
AMV反转录酶、 Taq酶、 T4 DNA连接酶、 限制性内切酶EcoR I和Sal I均为TaKaRa公司产品; 胶回收试剂盒、 质粒提取试剂盒购自博大泰克公司; LPS、 IPTG、 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为Sigma公司产品; 羊抗兔IgG抗体购自北京中山公司， 原核表达载体pET32a(+)， 抗His抗体和NiNTA亲和纯化试剂盒购自Novagen公司， 大肠杆菌DH5α、 BL21(DE3)由本院中心实验室保存。其余试剂为进口及国产分析纯， 实验用仪器和动物为本院和学校中心实验室及实验动物中心提供。引物合成及DNA测序由上海英骏生物公司完成。
1.2 方法
1.2.1 人外周血单个核细胞的分离与培养 在本院检验科门诊收集体检患者的静脉血（EDTA抗凝）， 其各项血液指标均正常， 按操作说明用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞， PBS洗涤后培养于RPMI1640培养液中(含100 mL/L胎牛血清， 脂多糖溶液10 g/L， 青霉素10 万U/L)。细胞经脂多糖刺激培养后， 提取RNA。
1.2.2 总RNA的提取 以Tripure分离试剂提取细胞总RNA， 具体步骤按德国Roche公司的Tripure Isolation Reagent操作说明进行。总RNA-70℃保存。
1.2.3 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增目的片段 由GenBank下载人TLR2全序列， 并根据原核表达载体pET32a(+)上的多克隆位点采用Primer Premier5.0设计一对TLR2胞外区扩增引物。上游引物为5′GCCGAATTCATGCCACATACTTTGTGGATGGT3′; 下游引物为5′CGGGTCGACTCACATTAAGGGTACAGTCATCAG3′。其中上游引物的5′端引入EcoR I的酶切位点（下划线表示）， 下游引物的5′端引入Sal I的酶切位点（下划线表示）， 内含启动子ATG和终止密码子TCA。以提取的细胞总RNA为模板， 按常规方法建立逆转录反应体系及条件合成cDNA。采用降落PCR(Touchdown PCR， TDPCR )的方法设置反应条件， 按引物的最小Tm值减5度设定温度梯度。反应条件为: 先在94℃变性3 min后， 94℃， 30 s; 62℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 60℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 57℃， 1 min; 72℃， 1 min; 10个循环， 94℃， 30 s; 55℃， 1 min; 72℃， 1 min; 12个循环， 最后72℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物， 切胶纯化回收目的片段。
1.2.4 重组原核表达载体的构建与鉴定 用EcoR I和Sal I分别双酶切纯化回收的目的基因片段和pET32a(+)表达质粒， 经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收后， 用T4DNA连接酶16℃过夜连接载体和目的片段， 得到重组表达载体pET32a(+)TLR2。重组质粒转化感受态表达菌株BL21(DE3)， 涂布Amp+的LB平板培养过夜， 挑选阳性菌落， 扩增后提取质粒， 双酶切鉴定， 对鉴定正确的质粒将其菌液送公司测序。
1.2.5 重组融合蛋白的诱导表达 将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)， 挑取单克隆接种于Amp+的LB液体培养基中， 37℃过夜培养。次日， 按1∶100的比例接种， 220 r/min， 37℃进一步扩大培养至细菌密度为A600=0.6时， 加入异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmoL/L进行诱导， 25℃继续培养4 h， 同时设含有空载体质粒和未诱导的菌液为阴性对照。离心收集诱导菌， 于2×SDS上样缓冲液中重悬细菌， 100℃煮沸10 min， 12 000 r/min离心5 min， 取上清进行SDSPAGE分析， 具体电泳方法参见文献［2］进行。
1.2.6 重组蛋白的纯化及鉴定 挑取单克隆菌落接种于30 mL的Amp+的LB液体培养基中， 摇床中37℃过夜培养， 按前述同样的方法诱导重组蛋白的表达并收集菌液， 4℃、 5 000 g离心15 min， 弃上清后用预冷的PBS洗涤2次， 加入溶菌酶至终浓度10 mg/L， 室温消化后置冰浴中超声破碎细菌， 将经过超声裂解处理后的细菌裂解液用NiNTA亲和纯化试剂盒纯化回收目的蛋白， 具体操作按Novagen公司产品说明书进行。收集过柱洗脱液， 用SDSPAGE检查纯化效果， Western blot检测目的融合蛋白。
1.2.7 抗血清的制备 用纯化的TLR2融合蛋白以500 μg/(只·次)免疫新西兰白兔， 初次免疫与福氏完全佐剂混合乳化后， 于背部皮下多点注射。以后每隔10 d加入等量的福氏不完全佐剂加强免疫共3次， 于第4次免疫1周后采血， 分离血清， 得到的多克隆抗体于4℃保存。
1.2.8 抗体的效价及特异性检测 将纯化的融合蛋白以10 mg/L的浓度包被至酶标板， 每孔50 μL， 待测抗血清倍比稀释后， 采用ELISA方法检测， 酶标仪测定A495的吸光度值为指标， 检测抗体效价。以纯化的蛋白为抗原， 制备的血清为一抗（1∶2 000稀释）， HRP标记的羊抗兔IgG为二抗（1∶2 000稀释）， 按常规方法利用Western blot检测抗体的特异性。
2 结果
2.1 人外周血单个核细胞总RNA的提取 提取出的总RNA经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 可以看到两条清晰的条带， 分别为28 S和18 S， 且约为2∶1， 表明获得较好的总RNA（图1）。
图1 人外周血单个核细胞总RNA的电泳图谱
2.2 TLR2胞外区目的基因的扩增 通过从人外周血单个核细胞中提取总RNA， 应用RTPCR技术， 利用特异性引物扩增目的基因。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示， 扩增产物大小约为1 000 bp左右， 同预期目的片段的大小符合（图2）。
2.3 重组表达载体的构建与鉴定 PCR的扩增产物经切胶回收纯化后， 用EcoR I和Sal I双酶切并连接到经相同酶切的pET32a(+)表达载体中， 双酶切鉴定， 结果表明TLR2胞外区目的基因已经正确克隆到原核表达载体pET32a(+)中， 阳性克隆送交公司测序证实插入序列和读码框架正确， 表明重组表达载体pET32a(+)TLR2构建成功（图3）。
2.4 融合蛋白的诱导表达及纯化 将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中， 经过IPTG诱导， 超声破菌后在上清中可获得目的蛋白的可溶性表达， 离心后收集的上清经NiNTA亲和层析纯化， 获得Mr约为38 000的蛋白带， 与预期的理论值相符（图4）。
2.5 Western blot对目的融合蛋白的检测 将诱导表达后的菌体蛋白经NiNTA亲和层析纯化后进行SDSPAGE， 然后转移至硝酸纤维素膜上， 进行Western blot分析。结果显示目的融合蛋白可以和抗组氨酸的特异性单抗反应， 呈现一条特异性的反应条带（图5）。
2.6 多克隆抗体的鉴定 抗TLR2多克隆抗体只与目的Mr的蛋白发生反应， 呈现单一条带， 而空白菌蛋白的对照组无任何条带出现， 表明所制备的抗体具有较好的特异性（图6）。ELISA测定效价结果显示， 当抗血清稀释至1∶3 200时仍呈现阳性反应。
3 讨论
TLR2作为Toll样受体家族中的重要成员， 其在免疫应答各个环节中的功能和作用日渐引起研究者的广泛关注。已知TLR2主要表达于单核细胞、 巨噬细胞、 树突状细胞、 部分T淋巴细胞和外周血白细胞［3］ 。TLR2可以识别多种病原体相关分子模式(pathogen associated molecular paterns， PAMPs)， 具有广泛的配体识别谱。近年研究发现， TLR2在识别B族链球菌引发宿主防御反应中发挥重要作用， 其生成产物使细胞壁的超微结构发生变化［4］， 并且能够诱导TLR2依赖的抗菌基因活化［5］。在TLR2识别各种配体的过程中， TLR1和TLR6扮演着重要角色， 它们与TLR2结合形成异物二聚体才能使TLR2诱导免疫应答， 分泌各种细胞因子， 发挥抗感染的作用。最近， Vanhoutte等［6］的研究发现， TLR2也能和TLR3结合共同作用而增强免疫应答反应。另外， TLR2在物理、 化学及缺血等非感染因素所导致的组织损伤以及组织修复的过程中也发挥重要作用。最近研究又发现TLR2参与β细胞的调亡并且诱导自身免疫性糖尿病的发生［7］， Tunheim等［8］又证明了TLR2能够有希望成为一种新型的重组免疫球蛋白疫苗用于预防和治疗一些自身免疫性疾病， 关于TLR2基因的多态性， 特别是TLR2基因多态性与感染性疾病和肿瘤易感性之间的关系更是深入研究的热点。可见TLR2在免疫应答反应中的重要性， 对其在各个方面的研究还有许多尚待阐明的问题， 而TLR2的胞外段作为其重要的功能区域， 更是值得在不同层次上加以深入研究。
在本试验中我们所使用的pET32a(+)是一种融合表达质粒， 其主要特点是除能够编码6个组氨酸残基外， 还带有大肠杆菌的TrxA基因， 它能够编码硫氧还原蛋白与外源蛋白融合表达， 提高表达产物的稳定性和可溶性。同时利用重组蛋白上的组氨酸标签可以和NiNTA琼脂糖树脂中的Ni2+结合的原理对融合蛋白进行纯化， 通过 Western blot利用抗组氨酸的特异性单抗对表达的目的蛋白进行初步鉴定， 实验结果显示TLR2胞外区的融合蛋白大小与预测值基本一致。已知多克隆抗体具有制备周期短， 血清滴度较高等优点而受到广泛的应用。在本实验中我们利用原核表达体系成功表达了TLR2胞外区融合蛋白， 并制备了多克隆抗体， 经鉴定抗体具有良好的特异性， 为进一步研究TLR2胞外区的结构和功能， 生物活性及信号传导途径奠定必要的基础。
参考文献
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免疫室自我鉴定总结篇8
2 提高血库常规检测试验的灵敏度和稳定性
输血实验室有2个最基本的试验用于血型鉴定,即直接血凝试验和用于抗体鉴定与配血的间接抗球蛋白试验(IAT)。IAT技术现在仍然被认为是经典的标准技术。但IAT技术重现性差和不便于自动化检测。从20世纪90年代开始,凝胶技术、亲和柱凝集技术和红细胞固相黏附分析这3中新的技术被相继应用到输血领域中。尽管这3种技术从操作步骤,所用实验仪器方面都与试管法不同,但实验原理上仍是抗原抗体相互作用后,通过红细胞的凝集来显示结果。这些新技术的设计目的是试管法试验的完善,即形成稳定的终点和便于自动化。而且这些新方法在血型检测时,所需的样本量较少,试验的重复性很好。且具有无需细胞洗涤以及对技术的依赖性降低等优点,特异性与灵敏度被认为是可与低离子强度间接抗人球蛋白试验相媲美。当然它也有一定的缺点,如在ABO和Rh定型试验也比较耗时,需20 min(10 min孵育,10 min离心);以及在获得试验体系高灵敏度的同时,也较易产生假阳性。
3 交叉配血试验显示不配合时的输血策略
随着输血前检查项目的增多和诊断试剂、实验体系灵敏度的提高,主次侧交叉配血不合的现象也日益增多。从实验室或医学文献中我们知道,许多因素将影响红细胞的免疫性破坏和体内存活。目前较明确的因素包括IgG的亚类、抗体激活补体的能力、抗体的总量、红细胞上抗原的数量、抗原从红细胞上解离的能力以及受血者单核吞噬系统的活力等。通过研究这些常规血清学试验的结果来推断输血后供血红细胞在受体内存活的状态,有时也是可能的。如利用预热技术,在37℃条件下进行配血试验,以判断抗体在正常生理体温条件下是否具有活性等等。但在另外一些情况下,则不得不采取一些非常规的方法,例如,同位素Cr51来测定红细胞的存活率;以功能细胞试验预判血型同种抗体的临床意义。这类功能细胞试验有3种:单核细胞单层检测、抗体介导的细胞毒试验和化学发光试验。这些试验都是通过抗体包被的红细胞和单核细胞之间的相互作用,以模拟致敏红细胞在体内被破坏的过程,同时结合抗体的红细胞被单核细胞吞噬后,在吞噬细胞内被裂解的这种红细胞在体内调理性吞噬的方式进行设计的。这些功能细胞试验可为我们在输血前提供一个该血型同种抗体是否有临床意义的评估,即在体外给我们模拟了一个输血后体内免疫应答的预试验。
4 血型基因诊断和临床应用
随着血型遗传学的迅速发展,通过分子遗传学技术已经能够独立地使血清学上的血型鉴定的困难或者不可能定型的血型鉴定出来。分子生物学技术的发展,使人们不断报道出以前未知的血型等位基因。但同时常常发生假阴性和假阳性结果。随着技术上的发展,定义不同的等位基因在人类血细胞上的表达已成为随之而来的更为重要的工作。而发现等位基因的时代也随之过渡到了探明基因表达阶段的时代。比如,用为矩阵的自动定型方法来取代血清学定型。此外,PCR产物与探针杂交后,通过芯片扫描可分析荧光强度的方法能够快速并且自动化地将供者和受者的血液进行“完全”定型,以增加输血的配合率,并将同种免疫反应的危险性降到最低。
临床上所发生的输血反应并不全都是有血型抗原的同种免疫造成的。有时,同样的血输给不同的人,会产生不同的结果。有研究发现恶性实体瘤、异基因干细胞移植、有糖尿病病史的患者产生同种免疫的风险性较高。机体处于炎症状态时,免疫反应可能增强等都有可能增加输血反应的发生。
免疫室自我鉴定总结篇9
口蹄疫(footandmouth disease， FMD) 是由口蹄疫病毒(footandmouth disease virus， FMDV)引起的偶蹄动物的急性、 热性、 高度接触性传染病， 世界动物卫生组织将其列为A类传染病之首， 该病一经暴发就会给畜牧业生产造成巨大的经济损失， 严重影响了政治、 经济的稳定发展， 世界各国都高度重视对该病的防控， 完善的诊断和检测技术体系是控制和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗体的ELISA方法不受血清型限制， 因此在疫情普查、 筛查感染动物、 防制效果评价和恢复无FMD状态等方面具有重要的应用。
FMDV的3D蛋白是具有469个氨基酸的病毒RNA依赖的RNA聚合酶， 又称病毒感染相关性抗原， 没有型特异性， 在FMDV所有非结构蛋白中， 3D抗原性最好， 检测3D的ELISA方法具有与检测结构蛋白的ELISA方法相当的特异性、 准确性和敏感性， 是评价动物是否接触过抗原的重要指标， 在检测中具有重要的应用前景［1-4］。
本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体（mAb）， 为建立更为完善的ELISA诊断方法和检测技术以及进一步研究3D蛋白的结构和功能提供基础资料。
1 材料和方法
1.1 材料 O/China99口蹄疫病毒、 BHK21细胞株、 牛抗FMDV高免血清均为本实验室保存， Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院惠赠， 3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠， SPF级雌性3～4周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所， 福氏佐剂、 聚乙二醇(PEG)1450溶液、 HAT、 HT 以及四甲基联苯胺(TMB)、 HRP 标记羊抗小鼠总IgG、 mAb亚型鉴定试剂盒均为Sigma 产品; RPMI1640 培养基、 新生牛血为Hyclone公司产品， FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司， HI Trap rProtein G FF， 1 m蛋白纯化柱为Amersham公司产品， NiNTA Purification System购于Invitrogen公司， 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组pET28a3D蛋白的表达、 纯化及活性鉴定 按文献［5］所述方法表达3D蛋白， 将可溶性表达的3D蛋白按NiNTA Purification System操作说明书进行纯化， 用SDSPAGE电泳鉴定纯化产物的纯度， 用Western blot鉴定其特异性。Western blot方法参照文献［6］进行: 以牛抗FMDV高免血清为一抗， Sigma公司辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗， DAB染色。
1.2.2 3D mAb的制备 （1）小鼠免疫: 取纯化的抗原按100 μg/只加等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射， 2周后用弗氏不完全佐剂第2次免疫， 剂量、 注射部位同前， 2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内侧皮下注射， 1周后采尾静脉血测抗体效价， 取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉加强免疫1次， 在此之后第3天融合。（2）阳性杂交瘤细胞株的建立: 采用常规的PEG融合的方法取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板， 取融合后第10～15天的细胞培养上清进行间接ELISA检测， 选择检测结果为强阳性的克隆扩大培养， 同时用有限稀释法至少连续克隆3～5次， 直至所克隆的细胞能够100%分泌抗体。将能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩增培养后， 冻存于液氮中。
1.2.3 腹水的制备 将0.5 mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔， 1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔， 7～10 d后， 当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水， 4℃， 12 000 g离心10 min后， 0.45 μm滤器过滤后用G蛋白柱纯化， 加500 mL/L甘油分装备用。
1.2.4 mAb效价滴定 间接ELISA方法鉴定， 用纯化的pET28a3D抗原包被ELISA板， 腹水从100倍开始做梯度稀释， 同时以Sp2/0腹水做同等稀释度对照。
1.2.5 mAb的生物学特性鉴定 (1)亚型鉴定: 用IgG亚类鉴定试剂盒Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（Sigma公司)鉴定， 按说明书中的捕获ELISA方法操作。(2)稳定性测定: 将阳性杂交瘤细胞体外连续传代培养3个月， 每隔10 d检测1次细胞上清液的ELISA抗体效价。同时分别复苏冻存1个月， 2个月， 3个月的阳性杂交瘤细胞， 用间接ELISA法测定细胞培养上清的抗体效价。(3)mAb的位点分析: 用ELISA叠加实验进行位点分析。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板， 加入100 μL mAb1， 37℃， 1 h， 洗涤3次， 加入100 μL mAb2， 37℃， 1 h， 洗涤3次， 加入羊抗鼠IgGHRP， 37℃， 1 h， 洗涤5次， 加入底物显色， 终止反应后测定A值。按照如下公式计算叠加率AI: AI=［A(1+2)-A1］/A2×100%。式中A1为mAb1的A值， A2为mAb2的A值， A(1+2)为mAb1叠加mAb2的A值。若AI>10％， 说明被测的2株mAb的抗原结合位点不同， AI≤10％则结合位点相同或相近。(4)特异性鉴定: ①Western blot: 将原核表达的pET28a3D蛋白和灭活的O/China99株感染的BHK21细胞裂解液分别进行SDSPAGE电泳， 然后按常规方法转印到硝酸纤维素膜光滑面上， 将膜置于封闭液中， 4℃， 过夜， PBST洗涤5次后分别置于5株杂交瘤细胞上清中， 设置阳性对照(免疫鼠血清)、 阴性对照(正常鼠血清)， 37℃作用1 h， PBST洗涤5次， 置于工作浓度的HRP标记羊抗鼠IgG溶液， 37℃作用1 h， PBST洗涤5次， 最后用TMB避光显色， 水洗终止反应。②间接免疫荧光: 接种FMDV O/China99于长满单层的BHK21细胞， 50 mL/L CO2、 37℃培养10 h， 弃去上清， 用洗涤液（PBS10 g/L BSA）洗涤1次， 37 g/L多聚甲醛室温固定10 min， 洗涤3次; 加入50 mmol/L NH4Cl， 室温作用10 min， 充分洗涤， 吸干残液; 加入杂交瘤细胞培养上清， 37℃作用1 h， 洗涤3次， 吸干残液; 加入工作浓度的羊抗鼠IgGFITC， 37℃作用1 h， 洗涤3次， 加200～300 μL 20 mL/L甘油PBS， 荧光显微镜下观察， 同时设立BHK21细胞作为阴性对照。
2 结果
2.1 重组pET28a3D蛋白的纯化及活性鉴定 纯化蛋白经SDSPAGE分析， 在相对分子质量（Mr）约44 000处有一条明显的蛋白带(图1A)， 与预期相符， 并且无明显的杂带， 这说明提纯的抗原较纯。Western blot结果显示， 纯化的原核表达抗原能够很好的识别FMDV感染的动物血清， 具有良好的反应性（图1B）。图1 3D蛋白的纯化及活性鉴定
A: 3D融合蛋白的SDSPAGE纯度鉴定; B: 3D蛋白的活性鉴定. M: 蛋白markers; 1: 纯化的pET28a3D蛋白; 2: pET28a3D蛋白的Western blot分析.
2.2 pET28a3D蛋白mAb杂交瘤细胞株的建立 以表达的重组蛋白免疫小鼠， 经细胞融合及5次克隆化， 阳性率达到了100%， 共得到5株稳定分泌抗3D蛋白的杂交瘤细胞株， 分别命名为: 1A6、 1B2、 1E5、 7H4和7C2。
2.3 抗体效价滴定结果以及亚类鉴定 结果如表1所示， 5株mAb的腹水抗体效价均高于105， 达到mAb腹水制备的要求。表1 mAb效价测定及亚类鉴定结果
2.4 mAb的生物学特性鉴定
2.4.1 稳定性鉴定 连续传代培养和按期复苏的杂交瘤细胞， 其上清的抗体效价一直稳定， 表明杂交瘤细胞能稳定分泌mAb。
2.5.2 位点叠加分析 表2结果显示， 其中1B2、 1E5、 7C2之间的叠加值均小于10％， 为识别同一个表位的抗体， 1A6和7H4与以上3株抗体的叠加值均大于或接近于10%， 识别不同或相近的表位， 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1的AI值相差较大， 但表位判定结果一致。表2 5株mAb位点叠加分析结果
2.5.3 特异性鉴定 （1）Western blot: 图2所示， 在Mr约44 000处有一条明显的蛋白带， 这表明所筛选出的5株mAb能与原核表达的3D蛋白发生特异性反应; 图3中在Mr约52 000和72 000处各存在明显的蛋白带， 分别与自然的FMDV 3D和3CD蛋白大小相符（2）间接免疫荧光: 在FMDV感染的BHK21细胞细胞质中均检测到很强的荧光（图4）， 而未感染FMDV的细胞检测结果为阴性， 这与GarcíaBriones等［7］所得结论一致。
3 讨论
高度纯的抗原是获得特异性mAb和提高筛选阳性率的关键。原核表达系统虽然没有蛋白翻译后的糖基化、 磷酸化等加工修饰过程， 不能完全反应蛋白的天然构象， 但是由于原核表达系统操作简便、 重组蛋白产量高、 可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化等诸多优点， 而且目前许多实验室已经利用原核表达的抗原成功的制备了能够识别自然蛋白的mAb［8， 9］， 因此， 本试验采用原核表达的重组3D蛋白免疫小鼠。
本实验在制备mAb的基础上利用叠加ELISA进行了抗原表位的初步研究， 若两种mAb的结合位点较远， 则将无干扰现象， 若结合位点较近或存在部分重叠， 则有干扰现象。运用叠加ELISA分析， 初步判定这5株mAb中有2株为同一表位， 其他为不同表位， 且mAb1叠加mAb2与mAb2叠加mAb1的A值基本相近， 虽然所测AI值差别比较大， 但表位判定结果基本一致。
本实验的目的是制备能识别自然3D蛋白的mAb， Western blot和间接免疫荧光结果显示所制备的5株mAb不但能与原核表达的3D蛋白特异性的结合， 而且能与自然3D蛋白发生特异性的结合， 这为我们建立基于mAb的间接捕获ELISA或竞争ELISA诊断方法、 研发新型的多重NSP抗体荧光检测技术以及进一步研究FMDV 3D的功能、 揭示FMDV的致病机制提供重要工具。
参考文献
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免疫室自我鉴定总结篇10
表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor， EGFR)是一种广泛分布于哺乳动物各组织细胞膜上的多功能糖蛋白， 又称ErbB1， 是ErbB膜受体家族的成员之一， 其配体包括EGF、转化生长因子α（TGFα）、双向调节蛋白（amphiregulin）等。EGFR由胞外区、跨膜区以及胞内区构成， 其胞内区有酪氨酸激酶活性， 当胞外区与配体结合后， 会促使EGFR构象发生改变， 从而发生受体同源二聚化或者与家族其它受体如ErbB2等发生异源二聚化， 进而激活胞内区酪氨酸激酶活性， 启动EGFR通路信号传递［1］， 发挥其促进细胞增殖等一系列生物学活性。
EGFR在机体组织受到损伤等情况下， 能够发挥促进细胞增殖从而加速受损组织修复过程的作用， 然而当EGFR发生基因变异或者在细胞表面过度表达时往往会伴随着肿瘤等疾病的发生与发展。临床研究显示， EGFR在肺癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈部肿瘤以及其他上皮源肿瘤中都存在高表达， 并与肿瘤患者病情进展、放化疗敏感性及预后直接相关［2］。自从1984年EGFR基因首次被克隆， 靶向EGFR策略在肿瘤治疗研究领域越来越受到研究者的重视［3］。我们采用原核表达系统表达了谷胱甘肽硫转移酶（GST）与鸡源EGFR胞外区片段的融合蛋白， 并对表达产物进行分离纯化及复性， 并以此融合蛋白进行动物实验， 评价其针对小鼠Lewis肺癌动物模型的主动免疫治疗效果。
1 材料和方法
1.1 材料 pMD18T Vector购自宝生物工程有限公司， pGEX4T2 Vector、 小鼠Lewis、 人A431癌细胞株为本实验室保存、 E.coli BL21（DE3）， 为本实验室保存。质粒pVAXⅠcE（chicken EGFR）内含编码鸡EGFR胞外段cDNA部分片段由本室既往构建。4周龄 C57BL/6J 小鼠 () 购自中国科学院上海实验动物中心。PCR体系kit、各种限制性内切酶、DNA片段纯化试剂盒、T4 DNA连接试剂盒、蛋白Marker， 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自上海华舜生物工程公司。山羊抗人EGFR抗体购自R＆D Systems， Inc.。兔抗羊HRP标记IgG购自Santa Cruz Biotechnology。DNA marker购自上海赛百盛基因技术有限公司。NiNTA Agarose 购自北京金螺旋生物科技中心。其余试剂及药品均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建与鉴定 以本实验室构建的重组质粒pVAXⅠcE为模板， 设计上游、 下游引物， 上下游引物分别是: F: 5′GCGAATTCACGGTGGCGGGGGTGGGGGCCATGG
CTCCTGCGTTCGC3′， R: 5′GCCTCGAGTTCAGTGATGATGG
TGATGGTGGCCCCAGCAGCCCACGTC3′（上海赛百盛公司合成）， 上下游引物设计有EcoRⅠHind Ⅲ酶切位点， 另外上游引物设计有6个甘氨酸柔性接头， 下游含有编码His6标签的序列。按照常规方法进行PCR扩增目的基因， 之后将目的基因片段和原核表达载体pGEX4T2用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切并用试剂盒从凝胶中回收， 连接后， 转化DH5α感受态细胞， 对转化子抽提质粒进行双酶切鉴定， 并送赛百盛公司进行测序鉴定。重组后的表达载体命名为pGEX4T2cE。
1.2.2 GSTcE融合蛋白在E.coli BL21中的表达及包涵体的纯化 鉴定正确的重组质粒pGEX4T2cE转化感受态BL21（DE3）细菌， 挑取单菌落按常规方法以1 mmol/L IPTG诱导4 h， SDSPAGE分析外源蛋白的表达。确定表达后， 扩大诱导规模， 表达后采用超声破菌方法获得包涵体， 采用NiNTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白， 经核酸蛋白检测仪检测收集洗脱峰， 并做SDSPAGE分析。
1.2.3 包涵体的透析法复性 纯化后的蛋白溶液分别在4 mol/L， 2 mol/L尿素溶液中透析12~24 h。再将其放在含150 mL/L（V/V）甘油、 1 g/L（g/L）PEG2000、 0.5 mol/L精氨酸、 1 mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、 20 mmol/L TrisHCl(pH8.0)的复性溶液中透析复性24 h。最后用含9 g/L NaCl， 20 mmol/L TrisHCI(pH8.0)缓冲液透析48 h， 每6 h换液1次， 均在4℃下进行。
1.2.4 重组蛋白免疫实验动物 从上海实验动物中心购买4周龄C57BL/6 J雌性小鼠， 14只小鼠随机分成实验组和对照组， 实验组小鼠用目的蛋白对其进行3次免疫， 位置为腹股沟淋巴结处皮下， 间隔时间为10 d， 免疫剂量为100 μg/只， 前两次免疫用氟氏完全佐剂， 第3次用氟氏不完全佐剂。对照组用PBS缓冲液进行免疫， 免疫程序与蛋白疫苗组相同。
1.2.5 Lewis肺癌动物模型的建立及抗肿瘤效果评价 （1）Lewis肺癌动物模型的建立: 收集对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞， 1 500 r/min离心3 min， 细胞沉淀用培养液重悬并计数， 以2×106个细胞/只的量接种到经免疫的C57BL/6J小鼠腋部皮下。（2）ELISA法测定抗体的效价: 选取生长良好的A431细胞， 经消化后制成细胞悬液并计数， 接种于96孔板， 每孔100 μL， 约含细胞1×103个细胞， 置细胞培养箱待其贴壁后， 弃上清液并用戊二醛固定， PBST（PBS加入5 mL/L的Tween20）洗板3次。每孔加入200 μL封闭液（内含10 g/L BSA的PBST）， 封口膜封板， 37℃ 2 h， 倾去封闭液， GSTcE蛋白疫苗组与PBS对照组的待测血清用封闭液按1∶500; 1∶1 000; 1∶2 000; 1∶5 000; 1∶10 000稀释， 每孔100 μL， 空白组加入生理盐水100 μL， 各个处理设置3个复孔， 37℃孵育2 h， PBST洗涤后， 加入山羊抗小鼠IgGHRP 100 μL ， 37℃孵育2 h， 经PBST充分洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。15 min后硫酸终止， 酶标仪上测A450值。(3)肿瘤体积的测量: 待荷瘤小鼠肿瘤大小肉眼可见后， 用游标卡尺每周3~4次测量肿瘤长、 宽、 高径， 计算肿瘤体积V=0.52×长×宽×高， 绘制肿瘤生长曲线。
1.2.6 统计学分析 使用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 表达载体的构建及其鉴定 以本实验室既往构建的载体pVAXⅠcE为模版进行PCR扩增目的基因642 bp（图1A）， 经赛百盛公司测序与GenBank中登陆号为M20386的序列比对正确， 该片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切后与表达载体pGEX4T2连接， 转化DH5α感受态细胞， 提取质粒进行酶切鉴定（图1B）， 筛选含正确大小外源片段的阳性克隆， 经测序鉴定重组质粒中插入序列为正确编码鸡EGFR胞外部分基因， 并含有编码His6的序列。
2.2 GSTcE融合蛋白在E.coli BL21中的表达及纯化 以pGEX4T2cE质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株， 平板筛选后得到含重组质粒的基因工程菌。挑取单克隆进行诱导表达， 条件为37℃， IPTG诱导4 h。超声破菌后目的蛋白大部分以包涵体形式存在， SDSPAGE显示， 在Mr 50 000附近有目的条带（图2泳道3）， 确定表达后， 放大规模诱导以获得大量目的蛋白， 破菌后包涵体经过初步处理采用镍离子亲和层析柱纯化， 纯化后得到相对单一的目的蛋白条带（图2泳道4）。
2.3 肿瘤体积的测量 为研究融合蛋白GSTcE疫苗能否抑制接种的肿瘤细胞成瘤， 小鼠预先免疫3次后接种肿瘤细胞， 大约1周左右各组均可清晰观察到小鼠腋下有瘤体生成， 随后每隔2 d测量一次肿瘤大小指标， 最终绘制荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图（图3）， 总体来看GSTcE组的肿瘤生长速度较NS对照组缓慢， 接瘤后19 d GSTcE组的平均肿瘤体积为3772.897 mm3而NS对照组平均肿瘤体积已经达到5470.14 mm3， 两者相比具有统计学意义（P
2.4 ELISA检测抗体效价 间接ELISA法检测经3次免疫的小鼠血清抗EGFR抗体的效价结果如表1所示， GSTcE蛋白疫苗组血清稀释比例1∶500至1∶5 000时A450值与NS对照组比较有统计学意义（P
3 讨论
EGFR在很多人类癌症细胞中过量表达， 尤其是在非小细胞肺癌中， EGFR的过量表达与肿瘤病灶的高转移率、 肿瘤的侵袭力、 差的预后、 低存活率直接相关［4］。因此以EGFR信号转导途径为靶向的肿瘤治疗策略已经成为国际上的研究热点， 其中古巴分子免疫中心的一个小组， 采用哺乳动物细胞体外表达了小鼠和人EGFR的胞外部分， 免疫小鼠后， MTT法检测免疫小鼠的血清在体外能够抑止EGFR阳性肿瘤细胞的生长， 而且， 疫苗能够明显降低肿瘤细胞的肺部转移率［5］。
近年来， 肿瘤主动免疫治疗策略逐渐发展起来， 其中研究最多的是肿瘤相关抗原（TAA）， 例如CEA、 P53、 EGFR等。适合肿瘤主动免疫治疗的理想肿瘤相关抗原要有以下三个主要特点: 免疫原性强; 广泛表达于各种肿瘤细胞; 区分于正常细胞， 有肿瘤特异性。在动物模型中， 已经有学者成功利用异种同源分子进行免疫， 打破了宿主的免疫耐受， 激活了机体的免疫系统并产生一定的抗肿瘤效果［6］。这也是本实验表达异种同源蛋白进行抗肿瘤研究的根本原因。我们的前期研究曾将异源EGFR胞外部分片段展示在T7 噬菌体表面， 构建了基因工程噬菌体疫苗， 抗Lewis肺癌动物实验结果显示， 疫苗刺激小鼠产生了体液免疫与CTL细胞免疫效应［7， 8］。
为了研究EGFR靶向的主动免疫治疗肿瘤新策略， 我们构建了异种同源EGFR蛋白胞外部分区域的原核融合表达载体pGEX4T2cE， 并成功表达了融合蛋白GSTcE， 经过金属离子亲和层析纯化和复性后， 用此融合蛋白作为疫苗， 在接种肿瘤细胞前对小鼠进行3次免疫， 之后给小鼠接种Lewis肺癌细胞， 观测荷瘤小鼠的生长健康状况， 并记录肿瘤长、 宽、 高径， 计算肿瘤体积。与对照组小鼠相比， 蛋白疫苗组小鼠肿瘤生长缓慢， 同时， 在第3次免疫之后， 间接ELISA法检测蛋白疫苗组小鼠血清中存在抗EGFR的抗体， 抗体效价为1∶5 000， 与对照组有统计学意义， 证明所表达的异种蛋白对小鼠有免疫原性， 激活了小鼠针对EGFR的免疫应答， 与对照组相比在一定程度上抑制了肿瘤的生长。相信这种基于信号转导途径而设计的疫苗在经过更深入的前期研究后， 将会有很好的临床应用前景。
参考文献
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免疫室自我鉴定总结篇11
1 材料和方法
1.1 材料 诺如病毒粪便标本为使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原检测试剂盒检测为阳性的标本。6周龄的雌性BALB/c小鼠， 购自中山大学实验动物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞系为本实验室保存。诺如病毒核衣壳蛋白表达重组质粒 pET28a（＋）NoroNP由本实验室制备及保存， 诺如病毒N蛋白基因的克隆、 表达和鉴定方法见文献报道［9］。PEGMW3350购自Sigma公司， HAT、 HT 和RPMI1640购自Gibco公司， 新生牛血清购自杭州四季青公司， 羊抗鼠IgG购自BOSTER公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 免疫小鼠 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白， 收集产物经Ni2＋亲和层析柱纯化， 以此纯化后蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠， 每次免疫剂量为70 μg/只， 免疫途径为腹腔免疫， 每间隔2周免疫1次， 累计免疫3次， 初次免疫使用弗氏完全佐剂， 后两次免疫使用弗氏不完全佐剂; 第3次免疫完成10 d后小鼠尾部取血检测免疫效果， 血清效价达到104后可脾内注射进行加强免疫， 3 d后取脾融合。
1.2.2 细胞融合 取免疫后小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规融合方法融合。
1.2.3 阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 融合后细胞用含HAT的RPMI1640培养液进行筛选， 10 d后待杂交瘤细胞生长至视野的1/3大小时， 取100 μL细胞上清用ELISA方法对抗体进行检测。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化， 待所有单克隆细胞培养液中抗体阳性率为100%时， 将生长状态良好并抗体ELISA值高的单克隆细胞扩大培养。
1.2.4 腹水的制备及效价测定 将6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL/只弗氏不完全佐剂， 诱导1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞， 7～10 d后可产生腹水。收集腹水离心除去细胞碎片。用重组蛋白(5 mg/L)作为抗原包板， 腹水从10-2起10倍稀释至10-7作为一抗（连续梯度稀释）， 羊抗鼠IgG作为二抗， 用间接ELISA方法对腹水效价进行测定。
1.2.5 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 采用PIERCE公司的Monoclonal Antibody Isotyping Kit(HRP/ABTS)对mAb的亚类进行鉴定， 按试剂盒说明书进行。
1.2.6 mAb特异性检测 用Western blot方法测定mAb对GⅡ组广州株诺如病毒衣壳蛋白， 及对天然GⅡ组诺如病毒粪便标本的特异性反应情况。
1.2.7 mAb配对试验和初步应用 将效价较强的N2C3、 N7C2、 N4B1 3株mAb用硫酸铵辛酸法纯化［10］， 并分别将这3株抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。将纯化过的抗体分别用5 mg/L浓度包被酶标板作为一抗， 诺如病毒衣壳蛋白作为抗原， 标上HRP酶的3株抗体分别作为二抗， 使用ELISA夹心法对mAb进行配对试验。配对完成后挑选灵敏度相对较高而本底相对较低的配对方式， 与PCR方法（本实验室建立）检验为诺如病毒GⅡ组阳性的水样腹泻患者粪便标本进行反应。
2 结果
2.1 分泌抗诺如病毒衣壳蛋白mAb的杂交瘤细胞株的建立 用pET28a（＋）NoroNP重组表达载体表达诺如病毒GⅡ组广州株的全长衣壳蛋白免疫小鼠， 取小鼠血清测效价， 在满意滴度下将小鼠进行脾内加强免疫， 3 d后取脾细胞与Sp2/0细胞进行融合。10 d后用纯化的NVNP 5 mg/L包被酶标板， 杂交瘤细胞上清作为一抗， 羊抗鼠IgG作为二抗检测抗体， 并同时用pET28a（＋）载体表达的轮状病毒蛋白作为阴性对照， 以排除与大肠杆菌BL21细胞成分和pET28a（＋）载体成份反应的假阳性抗体。对抗体分泌能力强的培养孔用有限稀释法进行2次克隆化， 共筛选出4株能稳定分泌抗诺如病毒核衣壳蛋白抗体的细胞株， 分别为N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。
2.2 腹水效价的测定 收集腹水， 用间接ELISA方法测定， 结果N2C3和N7C2 2株抗体最强， 腹水稀释至10-6P/N值为0.4; N4B1株抗体较弱， 腹水稀释至10-4P/N值为0.5; N8A9株抗体最弱， 腹水稀释至10-3P/N值为0.3（阴性对照P/N值为0.08）。
2.3 mAb免疫球蛋白亚类鉴定 用PIERCE公司试剂盒对mAbIg的类型和亚类进行特异性鉴定， 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和 N4B1）， 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和 N8A9）， 4株mAb轻链均为к链。
2.4 mAb特异性检测 4株mAb分别与表达重组蛋白和诺如粪便标本进行Western blot检测， 表达重组蛋白上由于带有表达载体上的T7和（His6）标签， 因而Mr比天然诺如病毒核衣壳蛋白（Mr为56×103～58×103）多了3×103左右。Western blot结果见图1， mAb不仅可以同表达重组蛋白进行特异性反应， 并且可以同天然诺如病毒核衣壳蛋白进行特异性反应。其中N2C3和N7C2的反应性较强， N8A9和N4BI对粪便标本的反应性较弱。
图1 mAb的Western blot分析（略）
Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbs
A: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.
2.5 mAb配对试验和初步应用
2.5.1 配对 N2C3、 N7C2、 N4B1 3株抗体每株都与自身及其他2株抗体用夹心法进行配对试验， 将表达蛋白稀释至0.16、 0.084、 0.056和0.042 mg/L作为样本进行检测。P/N值结果见表1。结果显示N2C3和N7C2可以进行自身配对， N2C3和N7C2之间可以互相配对， N4B1不能进行自身配对， 并且与其他两株配对效价都不高。
表1 N2C3、 N7C2和N4B1 mAb在夹心ELISA中的结果（略）
Tab 1 Sandwich ELISA results for N2C3， N7C2 and N4B1
2.5.2 初步应用 根据配对结果， 选择阳性值较高且本地值较低的N2C3＋N7C2E配对方式。将53份PCR检测为诺如病毒阳性的粪便标本取上清， 用PBS稀释10倍作为样本进行检测。结果显示， 35份标本ELISA检测为阳性（P/N值为 0.408～3.045之间， 阴性对照为0.170）， 相对阳性率为66％。
3 讨论
诺如病毒最早发现于1972年， 由Kapikian等［11］借助免疫电镜技术（IEM）观察到一种病毒颗粒， 并根据发病地区将此病毒命名为 Norwalk virus(NV)。此后， 越来越多的诺瓦克样病毒在世界各地被发现， 这些分离得到的病原都以其流行地区或发病特征等命名。1993年Jiang等［12］通过分析诺瓦克病毒的cDNA克隆的核酸序列发现其属于杯状病毒属（calicivirus）， 后根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较， 将人类杯状病毒（HuCV）分为3个基因组（genogroup）:Ⅰ组（代表株NV）、 Ⅱ组（代表株SMA）和Ⅲ组（代表株Sapporo）。现将这3组病毒统称为诺如病毒（Norovirus）。诺如病毒在我国最早发现于1995年［13］， 后于我国多个城市和地区均有发现。根据文献报道， 当前GⅡ组病毒为中国主要流行的诺如病毒［14］。
诺如病毒是单股正链RNA病毒， 其基因组长度为7～7.5 kb， 包括3个ORF， 其中ORF2编码一个Mr为58～65×103的病毒核衣壳蛋白［15］。由于诺如病毒在感染患者粪便中排毒量少， 排毒时间短， 且无法在体外感染细胞及动物模型来进行培养分离鉴定［16］， 因此为了对诺如病毒进行进一步的研究， 制备mAb， 或研制疫苗等， 都只能依靠表达系统来完成。自20世纪80年代通过杆状病毒表达系统确定了ORF2为病毒核衣壳蛋白编码序列后， 对诺如病毒的免疫学研究工作主要都通过表达ORF2来进行。
诺如病毒广州株NVgz01（DQ369797）为本实验室测出的本地流行株， 经同源性分析属于诺如病毒GⅡ组［17］， 符合我国人杯状病毒的流行趋势。过往研究者在研究ORF2时多采用杆状病毒载体系统来表达， 且表达的核衣壳蛋白可以自行组装成病毒样颗粒， 但杆状病毒表达系统相较于E.coli表达系统而言费时费力。E.coli表达系统操作简便， 重组蛋白产量高， 并且可以使用配套纯化方法对重组蛋白进行高度纯化。Tomoko等［18］的研究证实， 用E.coli表达系统也可以表达出用于免疫研究的病毒核衣壳蛋白， 并且证实重组蛋白具有良好的抗原性， 因而本实验也采用E.coli表达系统表达诺如病毒核衣壳蛋白。利用Ni2＋亲和层析柱对重组N蛋白进行纯化， 纯化后表达蛋白纯度占总蛋白的95％以上， 用此纯化后的重组蛋白作为抗原免疫小鼠， 然后制备mAb。为了保证制备mAb的特异性， 我们使用表达轮状病毒VP6的pET28a（＋）VP6BL21的细胞裂解液作为阴性对照， 确保了所获得的杂交瘤细胞分泌的抗体均是针对诺如病毒重组N蛋白的。经过多次克隆化， 共获得了4株稳定分泌抗衣壳蛋白抗体的杂交瘤细胞株， 并对mAb Ig的类型和亚类进行特异性鉴定， 结果2株mAb鉴定为IgG2a（N2C3和N4B1）， 2株mAb鉴定为IgM（N7C2和N8A9）， 4株mAb轻链均为к链。虽然本实验使用的二抗是羊抗鼠IgG， 但其能筛选出IgM的原因可能是此二抗识别的表位是位于IgG和IgM所共有的恒定区上， 因而在ELISA过程中此二抗也有可能识别出IgM。根据ELISA和Western blot检测结果分析， N2C3、 N7C2、 N4B1和N8A9均与表达衣壳蛋白有良好的反应性和特异性， 并且都与患者粪便标本中的天然诺如病毒具有反应性和特异性， 其中N2C3和N7C2 2株的反应性和特异性都较强。根据N2C3和N7C2的配对结果， 以重组表达蛋白作为样本进行检测时， 样本浓度稀释至0.042 mg/L时P/N值仍能达到1.139～1.452， 证明N2C3和N7C2 2株抗体之间的配对检测具有较强的灵敏性和特异性。在此配对结果基础上， 对53份PCR检测为Norovirus GⅡ组阳性的腹泻患者粪便标本进行检测， 共检出35份阳性结果， 阳性率为66％。出现PCR结果和ELISA结果不完全相符的原因可能是由于PCR方法的假阳性率比较高， 或是配对的两株单抗在病毒组内表现株型特异性， 这两种可能性都有待进一步研究证实。
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免疫室自我鉴定总结篇12
随着侵袭性真菌感染患病率和病死率的不断增高，真菌感染的诊断和治疗备受关注，亟须临床实验室在真菌鉴定和药敏试验方面提供确实的辅助诊断，以便提高临床诊断和治疗水平。现就我院2012年1月至2012年12月培养出的367例真菌感染病例的鉴定和药敏试验情况进行耐药分析和总结如下：
1 资料和方法
1.1 资料来源 367例真菌感染阳性标本均来自我院临床各科室，324例为痰液标本，32例为尿液标本，9例为粪便标本，其余4例为脓汁标本和脑脊液标本。
1.2 标本培养和鉴定方法 将送检标本接种至改良沙氏（Sabouraud's Medium）培养基，筛选出阳性标本；将阳性标本接种至真菌显色培养基的同时用蒸馏水和培养液制备成相当浓度的菌悬液加入真菌药敏测定试剂盒中。12-24小时后观察结果。
2 结果判定
2.1 菌种判定 真菌显色培养基只能鉴定出四种念珠菌：①白色念珠菌――绿色，翠绿色。②热带念珠菌――灰色、铁灰色。③克柔念珠菌――粉红色，淡紫色。④光滑念珠菌――白色，紫红色。其它，结合菌落和孢子形态大致鉴定为酵母样菌属和和霉菌，无法鉴定到菌种。
2.2 药敏试验 采用真菌药敏测定试剂盒，根据高低浓度测试孔的颜色变化分别判断为：敏感、中敏和耐药。药物种类包括；氟康唑、酮康唑、咪康唑、益康唑、制霉菌素、两性霉素B和5-氟胞嘧啶。
3 试验结果
367例真菌耐药率比较见表1。
空白区为此药不能用做临床治疗或我科未做临床观察，其中克柔念珠菌对氟康唑天然耐药亦不能用做临床治疗。注：R=耐药，I=中敏。
4 总 结
免疫室自我鉴定总结篇13
【关键词】 HSP65 PSA融合蛋白 PSA阳性B16肿瘤细胞 免疫治疗 肿瘤生长抑制
肿瘤的免疫治疗正越来越多的为人们所关注。但现在的免疫治疗仍然存在一定的问题。首先， 免疫后的肿瘤抗原不能很好地激发机体的细胞免疫作用， 限制了抗肿瘤治疗的效果; 其次， 肿瘤抗原的免疫原性差，使其不易被免疫系统识别， 无法产生高效的免疫应答[1]; 另外， 肿瘤抗原的特异性也较差， 易产生毒副作用。研究发现热休克蛋白（heat shock protein， HSP）可以激发树突状细胞的交叉提呈能力引导外源性MHCI类肿瘤抗原表位进入细胞免疫途径， 从而使外源性抗原诱导机体产生更为强大的抗肿瘤免疫作用[2， 3]。而在众多肿瘤抗原中， 前列腺特异性抗原（prostate specific antigen， PSA）是一种主要表达在前列腺癌组织中的肿瘤特异性抗原， 在正常的前列腺组织及其他组织中其表达量很少。这决定了PSA蛋白可以作为一种外源性肿瘤抗原应用于抗肿瘤的免疫治疗， 将其免疫机体后所产生的抗肿瘤免疫作用将具有较高的特异性且副作用更小[4]。故我们利用基因工程的方法将结核杆菌来源的HSP65和人PSA的部分MHCI抗原表位连接在一起， 并表达和纯化出了HSP65PSA融合蛋白。本实验中对这种融合蛋白的性质进行了鉴定， 并通过体外的细胞实验和体内的动物实验观察HSP65PSA融合蛋白的免疫激活活性以及其在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 HSP65PSA融合蛋白由本室自己表达纯化。羊抗人PSA单克隆抗体（mAb）购自Biodesign公司。HRP标记驴抗羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司。PcDNA3GFPPSA真核表达载体由本室构建， PcDNA3GFPPSA稳定转染的黑色素瘤细胞株（B16/PcDNA3GFPPSA）由本室建立。健康人浓缩白细胞来源于长春市中心血站。淋巴细胞分离液由中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物技术有限公司生产。6～8周龄的雄性C57BL/6小鼠购于北京维通利华实验动物有限公司。共聚焦显微镜购自日本奥林巴斯公司。流式细胞仪购自美国BD公司。
1.2 方法
1.2.1 对HSP65PSA融合蛋白进行Western blot鉴定 将融合蛋白HSP65PSA用PBS稀释后取5 μg上样， 同时取5 μg牛血清白蛋白（BSA）上样作为阴性对照， 然后进行120 g/L 的SDSPAGE电泳， 电泳完毕后把蛋白转移到硝酸纤维素膜上， 用50 g/L脱脂奶粉（1×PBS配制） 4℃封闭过夜， 加入羊抗人PSA mAb， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min; 加入HRP标记驴抗羊IgG， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， DAB显色。
1.2.2 对PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞进行鉴定 （1）共聚集显微镜鉴定: 细胞培养于含100 mL/L小牛血清和10 g/L G418的IMDM培养液中， 在37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养， 细胞呈单层贴壁生长， 每2～3 d传代1次。培养瓶中生长状态良好的细胞可直接在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。（2）FCM鉴定: 将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5 g/L的胰酶消化， 加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整细胞数为1×105/mL， 取500 μL单细胞悬液， 1×PBS洗2次， 滤网过滤1次后进行FCM检测。（3）斑点杂交法鉴定: 将生长状态良好的B16/PcDNA3GFPPSA细胞用2.5 g/L的胰酶消化， 加入无血清IMDM制备单细胞悬液并调整细胞数为2×109/L， 离心收集细胞， 加入100 μL细胞裂解液， 在沸水中煮5 min， 离心收集上清， 以上清原液、 原液2倍稀释、 原液4倍稀释、 原液8倍稀释4个浓度用负压泵抽滤在硝酸纤维素膜上， 同时以相同的方法取未转染的B16细胞上清和HSP65PSA融合蛋白溶液分别作为阴性对照和阳性对照， 点膜后的硝纤膜用50 g/L脱脂奶粉（1×PBS配制） 4℃封闭过夜， 加入羊抗人PSA mAb， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， 加入HRP标记驴抗羊IgG， 室温孵育2 h， 1×PBS洗膜3次， 每次10 min， DAB显色。
1.2.3 HSP65PSA融合蛋白对人外周血树突状细胞的免疫激活作用 将一单位的浓缩白细胞加入到50 mL PBS/EDTA缓冲液中， 并补充缓冲液总体积到100 mL， 将血/PBS/EDTA混合液沿管壁缓慢加入到含淋巴细胞分离液（2∶1）的离心管中， 3000 r/min离心25 min， 将上层血浆吸净后， 用滴管吸取位于中间界面的单个核细胞， 加入适量冷PBS/EDTA/血清缓冲液， 以1800 r/min的速度和1200 r/min的速度分别离心10 min， 离心管内的细胞用含100 mL/L 人AB血清的IMDM稀释后， 铺24孔板， 放于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养。2 h后吸出上清液中的非黏附细胞， 加1 mL完全培养液（含10 mL/L人AB血清、 200 U/mL IL4、 100 μg/L GMCSF的IMDM培养液）， 放于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中继续培养， 每3 d半换液1次， 新培养液中含2倍浓度的GMCSF和IL4， 7 d后于不同的细胞培养孔中分别加入HSP65PSA融合蛋白（100 mg/L）、 成熟因子（10 μg/L IL6、 1 mg/L PGE2、 10 μg/L TNFα ）、 LPS[5Eu/mL（1 μg/L）]、 LPS抑制剂（多黏菌素B）+HSP65PSA融合蛋白（1 mg/L+100 mg/L）， 并设未加任何处理因素的阴性对照孔， 第8天收获各孔中的细胞于不同的离心管中， 分别加入无血清IMDM， 1200 r/min， 每次5 min离心洗涤细胞2次， 再于每管加入FITC抗人CD86抗体， 并取一部分未加处理的细胞加入FITCIgG1作为FCM检测的设门细胞， 闭光冰上摇30 min， 1×PBS离心洗2次， 用PBS/EDTA悬浮细胞后立即进行FCM检测。
1.2.4 HSP65PSA融合蛋白抑制PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内实验 在C57BL/6小鼠右侧背下部靠近尾根部约0.7 cm处皮下注射3×105/0.2 mL 1×PBS B16/Pc DNA3GFPPSA细胞， 注射局部出现直径6～8 mm的皮丘， 视为接种成功。实验分组: 待全部小鼠都出瘤后， 将40只小鼠随机分为5组， 每组8只小鼠（1）PBS溶媒对照组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射200 μL1×PBS溶液， 50 μL/点; （2）未加处理因素对照组: 接种肿瘤后不加任何处理; （3）1 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射HSP65PSA融合蛋白1 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点; （4）10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处4点皮下注射HSP65PSA融合蛋白10 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点; （5）100 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组: 第1、 3、 7、 14天于小鼠四肢靠近淋巴结处四点皮下注射HSP65PSA融合100 μg/200 μL1×PBS， 50 μL/点。给药后每隔3 d测量肿瘤体积。肿瘤体积（V）按公式V=1/2ab2(a=瘤长， b=瘤宽)计算， 并绘制肿瘤生长曲线。
1.2.5 统计学处理 实验数据均以x±s表示， 显著性检验采用完全随机分组t检验和方差分析。
2 结果
2.1 HSP65PSA融合蛋白的鉴定 Western blot结果显示融合蛋白可以和抗PSA mAb结合（图1B）。融合蛋白的Mr约为87000（图1A）， 与理论计算值吻合， 对照上样孔未出现条带。
图1 HSP65PSA蛋白的Western blot分析（略）
A: SDSPAGE结果; 1: Protein marker; 2: HSP65PSA; 3: BSA. B: Western blot; 4: HSP65PSA; 5: BSA.
2.2 B16/PcDNA3GFPPSA细胞的转染结果 在共聚焦显微镜下可见90%细胞发出明亮的绿色荧光（图2）， 转染率较高。FCM检测结果与未转染的B16细胞相比较， B16/PcDNA3GFPPSA转染细胞的转染效率为63.13%。斑点杂交结果显示B16/Pc DNA3GFPPSA细胞裂解上清液中含有可以和抗PSA mAb结合的蛋白， 阴性对照上样点未显色（图3）。
图2 转染细胞共聚焦显微镜图片（×40）（略）
A: 激发绿色荧光; B: 普通光镜; C: A、 B图像重合.
图3 斑点杂交检测转染细胞（略）
A: 未转染外源基因的B16细胞; B: HSP65PSA融合蛋白; C: PcDNA3GFPPSA转染的B16细胞.
2.3 HSP65PSA对人树突状细胞表面CD86表达的影响 FCM测定显示， 与对照细胞比较， 加入融合蛋白HSP65PSA后树突状细胞表面CD86分子的表达发生了明显的上调， 上调率为52.93%， 这提示融合蛋白可以促进树突状细胞的成熟。同时我们也发现融合蛋白中的LPS杂质也可以在一定程度上促进树突状细胞表面CD86分子表达的上调， 上调率为27.77%， 但融合蛋白中的主要促CD86上调作用还是由其中的HSP65PSA蛋白成分引起的， 其对CD86分子的上调率为38.60%。与溶媒对照有统计学意义（P
2.4 HSP65PSA融合蛋白抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的体内实验 B16/Pc DNA3GFPPSA细胞接种于C57BL/6小鼠14 d后， 可在皮下摸到栗粒大小结节， 以后逐渐增大。所有移植肿瘤的小鼠均见肿瘤生长， 移植成瘤率为100%。每隔3 d测量1次肿瘤体积， 以时间为横坐标， 肿瘤体积为纵坐标做肿瘤生长曲线图（图4）。PBS阴性对照组肿瘤最大平均体积为（10.56±6.10） cm3， 未处理组肿瘤最大平均体积为（13.18±6.36） cm3， 1 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（10.55±4.51） cm3， 10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（4.91±5.21） cm3， 100 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组肿瘤最大平均体积为（6.52±3.60） cm3。其中只有10 μg HSP65PSA融合蛋白治疗组的肿瘤最大平均体积同PBS阴性对照和未处理组相比差异具有统计学意义（P
图4 小鼠的肿瘤生长曲线（略）
3 讨论
单纯的外源性肿瘤抗原免疫机体后通常只能诱导体液免疫反应， 而在肿瘤免疫中发挥主要作用的通常是细胞免疫反应[5， 6]。因此很多研究都希望找到一种方法将外源性的肿瘤抗原引入到细胞免疫途径中。研究发现， HSP可以通过活化树突状细胞将外源性MHCI类肿瘤抗原表位引导入细胞免疫途径， 并因此激活抗原特异性的CTL去攻击、 杀灭相应的肿瘤细胞[7， 8]。本实验中将HSP65同PSA的部分MHCI类抗原表位连接在一起制成了一种融合蛋白， 希望这种融合蛋白可以诱导机体产生针对PSA阳性肿瘤细胞的抗肿瘤免疫作用。
实验中我们从人的浓缩白细胞中提取了树突状细胞， 并用融合蛋白HSP65PSA在体外作用于未成熟的树突状细胞。通过对树突状细胞表面分子CD86的表达情况的检测， 我们发现我们的融合蛋白可以明显的促进树突状细胞表面分子CD86的表达。这说明融合蛋白HSP65PSA可以促进树突状细胞的成熟， 这种成熟的树突状细胞具有更好的抗原提呈能力， 这将有利于抗肿瘤免疫反应的发生。将融合蛋白以不同剂量免疫C57BL/6荷瘤小鼠后， 我们发现10 μg融合蛋白治疗组小鼠的肿瘤生长受到明显的抑制， 而1 μg和100 μg融合蛋白治疗组小鼠的肿瘤生长趋势并未受到明显影响。这说明10 μg HSP65PSA融合蛋白的免疫在小鼠体内产生了抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用， 且并非免疫的蛋白量越大抑瘤效果越好， 这一剂量将可能成为治疗PSA阳性肿瘤的有效剂量。
肿瘤抗原一直是抗肿瘤免疫研究的热点， 如何将外源性肿瘤抗原引入细胞免疫途径是抗肿瘤免疫治疗成败的关键。本实验中设计合成了一种HSP65PSA融合蛋白并通过相应的实验结果表明这种融合蛋白具有促进树突状细胞活化、 成熟的作用， 而且在小鼠体内产生了特异性的抗肿瘤作用。近年来， 已经有一些研究发现将HSP和肿瘤抗原制成融合蛋白并利用它进行肿瘤的免疫治疗是可行的[9]。本实验中也初步证明了HSP65PSA融合蛋白的免疫激活活性和在小鼠体内的抗肿瘤作用。这种融合蛋白将可以应用于前列腺癌等表达PSA抗原的肿瘤的治疗， 从而成为一种新颖的肿瘤免疫治疗方式。
参考文献
［1］ Siemens DR， Ratliff TL. Vaccines in urologic malignancies[J]. Urol Res， 2001， 29(2): 152-162.
［2］ Heike M， Weinmann A， Bethke K， et al. Stress protein/peptide complexes derived from autologous tumor tissue as tumor vaccines[J]. Biochem Pharmacol， 1999， 58(9): 1381-1387.
［3］ Manjili MH， Wang XY， Park J， et al. Immunotherapy of cancer using heat shock proteins[J]. Front Biosci， 2001， 6(12): 1346-1355.
［4］ Balk SP， Ko YJ， Bubley GJ. Biology of prostatespecific antigen[J]. J Clin Oncol， 2003， 21(2): 383-391.
［5］ 王万祥， 欧阳晓辉， 杨成旺. 基于肿瘤抗原的肿瘤免疫治疗[J]. 内蒙古医学院学报， 2005， 27（3）: 245-250.
［6］ 任淑萍， 包木胜， 高 新. HSP65MUCI/HSP65抗体免疫复合物对人树突状细胞的活化作用[J]. 吉林大学学报（医学版）， 2005， 31（2）: 182-185.
