植物组织培养论文:植物组织培养褐变产生探究论文

论文关键词:植物组织培养褐变酚类物质多酚氧化酶醌类物质

论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。

在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变原因及危害

褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。

2褐变产生的机理

2.1非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2酶促褐变

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。

在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，形成黑褐色物质，从而引起褐变。

3褐变产生的影响因素

影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

3.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

3.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

3.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

3.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

4防止外植体产生褐变的对策

从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。

4.1适当外植体的选择

取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。

4.2对外植体的处理

通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。

4.3适宜的培养基

培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。

4.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。

4.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

4.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。

4.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。

4.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。

4.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。

4.4添加褐变抑制剂和吸附剂

褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。

4.5进行细胞筛选和多次转移

在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。

植物组织培养论文:植物组织培养管理论文

论文关键词:植物组织培养褐变酚类物质多酚氧化酶醌类物质

论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。

在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变原因及危害

褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。

2褐变产生的机理

2.1非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2酶促褐变

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。

在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，形成黑褐色物质，从而引起褐变。

3褐变产生的影响因素

影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

3.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

3.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

3.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

3.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

4防止外植体产生褐变的对策

从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。

4.1适当外植体的选择

取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。

4.2对外植体的处理

通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。

4.3适宜的培养基

培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。

4.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。

4.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

4.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。

4.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。

4.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。

4.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。

4.4添加褐变抑制剂和吸附剂

褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。

4.5进行细胞筛选和多次转移

在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。

植物组织培养论文:濒危植物南川木菠萝组织培养技术研究

摘要 南川木菠萝是我国最为珍稀的特有极危物种之一，开展其组织培养研究具有十分重要的意义。从外植体选择到幼苗移栽，对南川木菠萝组织培养各相关环节进行了研究。首次建立起了南川木菠萝的组织培养体系。结果表明：南川木菠萝组织培养适宜的外植体为带芽茎段，并探明了获得无菌外植体的方法；南川木菠萝愈伤培养的挑选培养基为WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3） mg/L 6-BA+3 g/L PVP，芽诱导挑选培养基为WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP，生根挑选培养基为WPM+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 g/L PVP；适宜的组培苗炼苗时长为6～9 d，使用灭菌营养土较好，移栽存活率可达90%以上。

关键词 濒危植物；南川木菠萝；组织培养

南川木菠萝（Artocarpusnanchuanensis S.S.Chang），别名南川面包树、水冬瓜、瓜瓢、大杨梅，是多年生高大乔木植物，系桑科波罗蜜属中分布在我国最北端的植物种。1989 年由中国科学院昆明植物研究所吴征镒院士和张秀实教授在《云南植物研究》11 卷第1 期上正式发表定为桑科的一个新种[1]。2004年，南川木菠萝被《中国物种红色名录》确定为“极危”物种，是我国最为珍稀的特有植物之一[2]。目前报道，主要分布于重庆部分区、县[3]，已发现并得到良好保护的野生南川木菠萝有6 个居群，结果母树100株左右[4]。

目前，野生资源调查显示南川木菠萝喜光，耐贫瘠；散生于海拔900 m以下的山地、丘陵[3]；树干直立、粗壮，树高可达25 m以上，树干胸径可达60 cm以上，低分枝，树叶繁茂；叶革质，长圆形、椭圆形或近圆形，表面光滑，叶绿色或浓绿色（图 1）。因此，南川木菠萝表现出树形美观，抗逆性强，病虫害极少，具有较好的园林景观和生态效应，是难得的行道树、庭园绿化的品质树种。2008 年重庆市将其确定为主城新城区9 个基调树种之一[2-3]。另外，南川木菠萝果实形似面包（图 1），具有较高的营养和医用保健价值，含有人体必需的多种糖、蛋白质、氨基酸和酯类以及一些人体所必需的微量元素和多种维生素，可加工调制出风味独特、品质优良的果酒、果汁、果脯及果酱等；通便通气的效果明显，对便秘等肠道疾病具有较好的控制作用，民间使用表明，其树皮和树根对人体的皮肤病有较好的疗效。其木材红棕色，纹理细密、质地坚硬，可用来制作家具。因此，南川木菠萝可以从园林、饮料食品、医药保健、经济木材等方面进行开发利用[3]。南川木菠萝的价值逐渐引起了相关单位的关注并初步展开了引种工作。例如，贵州亚热带作物生物质能源研究所周正邦等[5]研究表明，南川木菠萝可以成功引种到贵州望谟和兴义等地，这对贵州热区生态建设、特色农业开发等具有重要意义。为增加贵州特色优新物种，同时引种的太平洋面包树则不能安全越冬。

但是，南川木菠萝种子具有休眠特性，少数休眠期可长达1年，发芽出苗不一致。因此，南川木菠萝的自然更新和繁衍能力极差。人工繁殖多为播种繁殖，秋播采用随采随播，春播需要进行沙藏处理。可扦插繁殖，但成活率低[3]。相关单位对这一珍稀物种资源进行了多年的调查研究，南川木菠萝的种子繁殖技术取得了某些阶段性成果[2]，形成了扦插繁殖方法，但扦插成活率仅50%左右[6]，其繁殖受到季节影响，且需要大量土地和人工，不利于规模化生产。因此，建立南川木菠萝的组织培养技术可很好地保护南川木菠萝这一濒危植物资源，解决产业开发所需种苗。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料采集于重庆市綦江区东坡镇南川木菠萝野生群，选用10年以上南川木菠萝植株的幼叶和幼嫩枝条进行组织培养体系的建立。将幼嫩枝条剪切成带有1～2个芽、长3～6 cm的带芽茎段和长2 cm左右的无芽幼嫩茎段。以南川木菠萝幼叶以及制作好的带芽茎段和无芽幼嫩茎段作为组织培养的外植体。

1.2 材料处理

1.2.1 无菌外植体的制作。将幼叶、带芽茎段和无芽幼嫩茎段先用流水冲洗20 min，蒸馏水冲洗3～5次，然后在超净工作台用75%乙醇处理30～60 s，无菌水冲洗3次，再用 2%次氯酸钠（滴加几滴tween-20）处理10～15 min，无菌滤纸吸干水，接种至相应培养基上进行培养。

1.2.2 组织培养方法。消毒完成的带芽茎段首先放入枝条生长培养基，再选取重新生长出来的幼叶切割成1～2 cm2的外植体进行愈伤诱导。直接从成年大树上采集的幼叶和幼嫩茎段经过消毒处理后，幼叶切割为1～2 cm2，幼嫩茎段切割为1.5～2.0 cm直接进行愈伤诱导。外植体诱导形成的愈伤，再经过芽的分化诱导、生根培养及移栽成苗。

1.3 培养基配制

采用高压蒸汽进行培养基灭菌，设定在121 ℃、0.105 MPa 的压力下，灭菌15～20 min，灭好备用。

1.3.1 枝条生长培养基。以WPM（Woody Plant Medium）为基本培养基，附加3 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Polyvinylpyrr-olidone）。

1.3.2 愈伤诱导培养基。以WPM为基本培养基，pH值为5.7，附加6-BA和2，4-D或IAA，具体浓度设计组成如表1所示。PVP附加浓度为3.0 g/L。每个处理设计30个外植体，统计愈伤诱导率（愈伤诱导率=形成愈伤外植体数/总外植体数）。

1.3.3 芽诱导培养基。以WPM为基本培养基，pH值为5.8，附加不同浓度6-BA、NAA和3 g/L的PVP，6-BA设计5个浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，NAA设计2个浓度分别为0.1、0.2 mg/L，不同浓度的6-BA和NAA进行两两组合配制培养基。每种激素组合接种愈伤3瓶，每瓶接种带有愈伤的外植体5块，并统计芽诱导率。

1.3.4 生根培养基。以WPM为基本培养基，pH值为5.8，附加不同浓度IBA、NAA和3 g/L的PVP，IBA设计4个浓度为0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，NAA设计2个浓度为0.1、0.2 mg/L。每个浓度处理使用20个幼苗，统计出根苗数，计算生根率[生根率（%）=生根苗数/总苗数×100]，3个月后结束生根统计。

1.4 培养条件

愈伤诱导阶段采用暗处理，28 ℃，48 h，其他无菌培养条件为白天温度25 ℃，夜晚18 ℃；光照强度1 000～2 000 lx；光暗周期15 h/9 h；相对湿度80%。琼脂用量为6.0 g/L，培养基pH值5.8。

1.5 炼苗移栽

将盛放有生根的无菌南川木菠萝幼苗的培养瓶去掉封口膜进行炼苗，炼苗后再移栽于营养土中生长。营养土使用patel peat（England newton international Group CO.，Ltd.），营养土处理设计灭菌（121 ℃、0.105 MPa，灭菌15 min）和不灭菌。炼苗时间长设计5个处理，分别为0、3、6、9、12、15 d，每个处理10株。统计移栽存活率[移栽存活率（%）=存活苗数/移栽总苗数×100]。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对南川木菠萝愈伤诱导的影响

取无菌带芽茎段新长出的嫩叶，并切割成约1.0 cm×1.5 cm大小的外植体，置于附加不同激素的愈伤培养基进行愈伤诱导。接种10～12 d后，叶片周围明显增厚，体积膨大，周围先形成愈伤组织。30 d后进行愈伤诱导统计，结果表明不同激素和浓度其愈伤组织诱导率差异明显，附加 2，4-D的培养基愈伤诱导率为17%～，而附加IAA的愈伤诱导率为7%～50%。附加2，4-D对南川木菠萝叶片愈伤的诱导以2.0 mg/L水平好，平均诱导率约为98%，比1.0 mg/L和3.0 mg/L 2，4-D的平均诱导率分别高70、11个百分点。在研究中2，4-D对南川木菠萝叶子的愈伤诱导效果比IAA好，其中WPM+2.0 mg/L 2，4-D+0.2（或0.3）mg/L 6-BA以及WPM+3.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA诱导率高达（表1）。

2.2 不同外植体南川木菠萝的愈伤诱导

从母株上采取的嫩叶、无芽幼茎在各愈伤诱导培养基中培养7～10 d后表现出褐化现象（图2A、B）；而带芽茎段在枝条培养基培养20～25 d可长出新叶，再利用长出的新叶作为外植体可在愈伤培养基上形成良好愈伤（图2C）。因此，本研究在进一步探索南川木菠萝的组织培养体系时，以带芽茎段长出的新叶为材料进行愈伤诱导、幼芽诱导及生根培养的研究。

2.3 不同激素组合对南川木菠萝芽诱导的影响

在愈伤培养基中培养3～4周后转入芽诱导培养基，不同激素组合的芽诱导培养基对愈伤组织培养的褐化程度不同，其中附加1.0 mg/L和5.0 mg/L的6-BA愈伤褐化程度较高，本研究使用的30个愈伤外植体没有诱导出芽（图2D），附加2.0 mg/L和3.0 mg/L的6-BA的培养基芽诱导效果较好（图2F），其中培养基WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 g/L PVP芽诱导率较高，30个外植体可诱导60个芽。当提高6-BA附加浓度到4.0 mg/L，芽诱导率极低，30个外植体诱导出2个芽，且褐化较重（图2E）。NAA的浓度以0.2 mg/L与6-BA 的组合，较适宜南川木菠萝芽的诱导。

2.4 生根培养

当芽伸长到3～5 cm时，从基部切取幼苗，并带少量愈伤接入生根培养基。不同激素对南川木菠萝芽的根诱导，以培养基WPS+1.5 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+3 mg/L PVP效果好，生根率达75%，相对较高，1个月左右可使幼苗生根（图2G、H），而附加1.0 mg/L的IBA培养基生根需要约2个月，且生根率为25%，相对较低。当基础培养基中附加0.5、2.0 mg/L的IBA时，3个月内不能诱导出根。

2.5 幼苗驯化移栽

幼苗在生根培养基生长到6～8 cm时开始炼苗移栽，移栽前揭开封口膜进行炼苗。之后去掉大部分叶片和残留培养基，保留2～3片叶移入灭菌营养土。本研究结果表明，灭菌营养土可以提高移栽存活率，在炼苗6 d的情况下，移栽15株幼苗存活14株，而使用未灭菌营养土移栽15株幼苗存活7株，可能由于灭菌营养土菌体相对较少，能更好使无菌苗适应由无菌环境转入有菌环境。炼苗时间6～9 d比较适宜，在灭菌营养土中存活率可达90%，而0、3、12、15 d炼苗时长相应的存活率分别为10%、30%、50%、30%。当炼苗时间较短时进行移栽，幼嫩茎段易干枯，影响存活率，炼苗时间较长则容易长菌，而且失水严重，降低移栽存活率。苗期要注意保持水分，使营养土保持润湿，移栽后约7 d即可恢复生长（图2I）。

3 结论与讨论

本研究建立的南川木菠萝组织培养繁殖体系，幼叶愈伤率达，芽诱导率200%（30个愈伤外植体可诱导出60个芽），生根率达75%以上，移栽成活率90%以上。因此，可以利用该技术开展南川木菠萝的规模化生产。本研究中无菌南川木菠萝组培苗进行移栽时，使用灭菌营养土可以提高移栽成活率，可能由于灭菌营养土菌体相对较少，能更好使无菌苗适应由无菌环境转入有菌环境。

南川木菠萝是一种高大乔木植物，在进行组织培养时褐化现象比较严重。本研究表明，PVP、适当的激素浓度和配比可以一定程度减缓褐化现象，探索抑制组织培养中的褐化现象，将是改良南川木菠萝组织培养技术的途径之一。例如，本研究对愈伤进行芽诱导时，如果在芽诱导培养基中附加1.0 mg/L的6-BA，愈伤呈现发育缓慢，培养3 d左右即出现较严重的褐化现象，不能分化出芽；当6-BA浓度增加到3.0 mg/L时，褐化相对较轻，能分化出芽，可能与提高6-BA的浓度进而促进细胞分裂有关；当6-BA浓度增加到5.0 mg/L时，褐化相对1.0 mg/L的浓度轻，但较3.0 mg/L浓度严重，且发育缓慢，检测的30个外植体中没有芽的分化，可能是高浓度的6-BA破坏了组织发育的激素平衡。可溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，用于防止褐化的发生，PVP能减轻南川木菠萝组织培养中的褐化率，2～5 g/L的浓度都有作用，以3 g/L效果较好。一些研究表明，除了聚乙烯吡咯烷酮（PVP），硫代硫酸钠（Na2S2O3）、活性炭、Vc、柠檬酸等抗褐剂能减轻愈伤的褐化率[7-9]，褐化程度还与培养基中激素种类和浓度密切相关，合理使用激素能有效促进细胞生长，缓解褐化[10-12]。

植物组织培养论文:农村青年植物组织培养技术职业培训存在的问题及改进措施

摘要 本文对农村青年中开展的植物组织培养技术培训进行探讨，分析了培训过程中存在的问题，总结相应的改进措施和取得的成效，以期为后期该项技术的进一步培训推广提供参考。

关键词 农村青年；植物组织培养；职业培训；问题；措施；成效

植物组织培养技术是繁育苗木花卉种苗的一种新方法。它是在无菌的环境条件下，将离体的植物材料接种到人工合成的培养基上，并控制相应的温度、光照、湿度等环境l件，使植物材料正常生长、分化并再生成完整植株的过程。植物组织培养技术对于植物优良品种的繁育、无病毒苗木生产、新品种选育、种质资源保存等方面有着较大的优势，同时也产生了巨大的经济效益和社会效益。目前，农村对于这项技术也在逐步推广。现就农村青年中对于植物组织培养技术职业培训过程中存在的问题、解决措施及取得的成效进行探讨，为后期的继续培训提供参考意见。

1 存在的问题

1.1 培训教材选用不适

本期教材按照培训大纲编写，语言过分生硬，内容大多采用专业术语，使得本身文化水平偏低的农村青年在没有接受专业教育的前提下难以接受授课教师在培训时所述内容，并且不能够理解教材上的专有名词。培训后学员也没有花时间复习，导致学员所学知识都是一知半解，对于后面知识的进一步学习造成很大的障碍，导致即使是经过了系统培训的学员也不能够正确理解授课教师所述的内容，造成了学员在经过系统培训后，并不能够真正掌握这项技术[1-2]。

1.2 学员组织纪律涣散

本期所培训的学员年龄大多在28周岁以上，由于与接受学校正规教育已有很长时间，所以突然集中学习则打不起精神。考虑到学员白天在家要干农活，所以前期理论知识培训都安排在19：00开始，虽然培训时间安排在夜间，但是大多数学员仍有各种原因不能按时到场，即使到场的学员也不能够认真听取培训教师的讲解，导致培训进度滞后[3-4]。

1.3 实践操作动手能力差

由于植物组织培养对于实践操作要求较高，所以在实践操作中，采用先演示再逐个操作的流程进行。发现在操作过程中大部分学员并不能灵活使用各种接种器械和相关仪器，动作比较生硬、丢三落四，整个无菌操作不太标准和规范，导致组培试验出现误差，甚至整个试验的失败。同时，大部分学员理论和实践过程中虽然遇到各种问题，由于思维方式的固定，并不能理解并接纳教师的意见和建议，依然按照自己的想法进行，导致培训结果不太理想。

1.4 思维方式局限

农村青年由于教育水平有限，认识面较窄，即使培训教师在对基本问题进行讲解时，他们也不能够很好地去理解问题，客观地面对问题，寻找解决问题的方法，在原本简单的问题上却要使用一成不变的方法，不能够很好地运用科学思维方式来解决问题。这是他们一直以来所受到的教育方式及水平导致的，他们的思维方式受到一定的局限。

1.5 观念滞后

农村青年因生活在科技文化普及滞后的农村，接触植物组织培养技术之初并不能在观念上引起他们的重视，面对新事物，他们并不确信这项新的技术能给他们带来可观的经济收益，故而对培训也只是抱着试试看的心态，这也就导致了培训时不能很投入地认真学习。

2 改进措施及成效

针对上述存在的问题，采取了一系列措施，取得了良好的效果。

2.1 调整教材，改变教学方法

使用通俗易懂的语言改编教材，并且通过不断的培训，发现问题，及时找到教材的缺点并改正，尽量使得教材内容完整，使得农村青年在自己单独阅读的时候也能够理解教材内容。同时，在培训过程中，授课教师使用讲解与视频相结合的方法，图文并茂，简洁明了，既提高了学员的兴趣，也使其逐步变被动学习为主动学习。

2.2 实践与理论结合，增强动手能力

为了让学员尽快在培训过程中有效地将理论与实践充分结合，掌握无菌操作的要点，特地选择了不同植物的叶片、茎段、茎尖为外植体，从材料如何消毒到如何接种到培养瓶的相关步骤都是通过一个人现场操作，另一个在旁边解说的形式完成。学员一边拍照，一边做记录。讲解完成后，学员亲自开始操作，然后教师再针对操作中的问题，现场解答。通过3～4次课的学习后，发现学员已对整个无菌操作要点有所掌握，对于后期知识的进一步学习也变得容易多了。

2.3 大力宣传现代农业技术，增强学习主动性

通过职能部门大力宣传国家现代农业科学技术，降低现代农业成本，提高经济效益，让当代农村青年正确理解现代农业科学技术的重要性，发挥农村青年能吃苦的精神，为国家现代农业发展做出贡献，使得农村青年正确认识现代农业科学技术，提高他们对现代农业技术的兴趣，增强他们学习现代农业技术的主动性。

3 结语

通过对农村青年现代农业科技知识的培训，能够激发当代农村青年的学习积极性，从而让他们重新拿起课本，接受现代农业的再教育，并进一步提高农村青年的创新精神，提升他们的实践动手能力及创新意识，使其有效地认识到现代科技农业的发展，为利用新的方法繁育种苗和花卉打下坚实的基础。

植物组织培养论文:植物组织培养技术在中药资源中的应用

[摘要] 植物组织培养技术以其独特的优势被广泛的应用于中药资源领域，在中药资源保护方面发挥了重要的作用。该文综述了近年来植物组织培养的一些应用，包括植物组织培养生产药用植物活性化合物、遗传多样性分析、道地药材、诱导子应用、生物合成及转基因植物等。通过以上研究将进一步促进植物组织培养技术的发展，使其在中药资源领域发挥更大的作用。

[关键词] 植物组织培养； 中药资源； 诱导子； 生物合成

中药资源是我国中药产业的基石，随着我国中药工艺的快速发展，大型和超大型企业不断涌现、形成和发展，对我国的中药资源形成了很大的压力，近些年中药材濒危资源的不断增加，中药材价格的不断增长，足以表明我国资源保护和可持续利用工作的紧迫性和重要性。通过发展植物组织培养技术来解决中药材的资源问题，对我国具有特殊而且重要的意义。植物组织培养技术的应用可以体现在以下几个方面：①通过植物组织和器官培养生产活性成分，保护濒危和珍稀药用植物资源；②通过遗传多样性分析，对植物组织培养材料进行评价；③通过植物组织培养技术研究道地药材遗传机制和环境机制；④通过诱导子的添加提高培养物中活性成分含量；⑤利用植物组织培养物进行基因功能筛选、验证及遗传转化研究。本文将从以上几个方面综述近年来植物组织培养技术在中药资源领域中的应用。

1 植物组织培养生产药用植物活性化合物

药用植物细胞，毛状根和不定根培养技术是生产药用植物次级代谢产物的一种非常有价值的工具。因此，通过细胞培养生产次级代谢产物的植物将近1 000种，超过600种的活性成分直接由植物细胞培养提供。目前，100多种毛状根已经成功的被发根土壤农杆菌诱导[1]，主要通过优化培养基和关键生理因素去增加毛状根培养的次级代谢产物的生成。目前，人参，三七，柴胡，甘草，丹参，雷公藤和许多种药用植物已经制定了不定根培养体系。目前，为了大量的生产次级代谢产物，细胞、不定根、毛状根已经成功地应用于大规模培养。例如，人参不定根培养已经达到3万L。金丝桃不定根已经达到500 L，紫锥菊不定根已经达到1 000 L[2]。韩国，CBN生物科技公司，每年生产大约40～45 t人参不定根，这是一个利用植物组织培养生产药品、食品和化妆品的成功范例。主要研究了培养条件的优化和诱导子的使用来提高次级代谢产物的含量。由WHO资助的半合成青蒿素已经被赛诺菲公司研制成功，其用发酵方法由单糖生产的青蒿酸在2013年已形成60 t左右产能。Phyton为成为世界经验丰富的高品质紫杉醇生产商已进行了巨额投资。我国具有通过植物细胞发酵生产紫杉醇的巨大a能，杜绝了对紫杉树种植的依赖，也避免了他们与环境、可持续性、性和质量稳定性相关的固有问题。近年来药用植物细胞，毛状根和不定根次级代谢产物的积累情况见表1。

近年来，药用植物细胞，毛状根和不定根培养受到了广泛关注，因为它提供了许多植物次级代谢产物。总的来说，药用植物的细胞，毛状根和不定根是逐年增加的，并且它的培养规模已经逐渐扩大。

2 遗传多样性分析

植物组织培养是植物快速大量增值的一种潜在工具，并且有利于控制重要次级代谢产物的生成。然而再生植株的遗传基因会发生一定程度的变异，从而造成植株化学成分的改变及其临床疗效的差异，影响组织培养的优点[40]。因此，必须保障组培植株基因的一致性，以确保植株的质量。用于监测遗传基因变化的方法有简单重复序列，随机扩增多态性DNA和相关序列扩增多态性。

简单重复序列通常形成具有具体基因，少许具体标记物的种族。随机扩增多态性DNA方法是一种PCR技术，随机扩增DN段，使用低于低退火温度的核苷酸序列的单一引物。这个技术已经广泛用于种族分类，遗传作图和种系发生[41-42]。在吊灯花属快繁的研究中，在植株的直接芽器官发生，间接芽器官发生和母本植物之间比较基因稳定性，结果显示通过简单重复序列和随机扩增多态性DNA方法，直接芽器官发生的基因和母本植物是相似的，间接芽器官发生的随机扩增多态性DNA指纹图谱显示出低的变异率[40]。相关序列扩增多态性是简单的有效地生产高再生性和多功能性的全组基因片段。在人参悬浮细胞培养中，通过随机扩增多态性DNA方法在悬浮细胞与幼苗之间比较基因稳定性，结果显示悬浮细胞的基因和幼苗是相似的[43]。在拟南芥悬浮细胞培养中，通过简单重复序列方法来比较悬浮细胞和拟南芥植株的基因稳定性，发现悬浮细胞的基因和幼苗是相似的[44]。

3 道地药材

道地性归根结底是道地药材所拥有的基因型受到特定生境（道地产区）中环境因子诱导后表达的产物。因此，基因表达是道地药材研究的重要环节，而功能基因表达的调控是道地药材研究的目标之一[45]。揭示道地药材和非道地药材在基因表达方面的差异是道地药材功能基因研究的重要内容。由于基因表达对研究所用RNA材料的要求较高，且通常需要通过对比实验来完成，造成道地药材基因表达及调控实验目前主要集中在实验室中。由于细胞培养和组织培养周期较短，材料易于获得，均匀性较好，因此道地药材功能基因表达与调控研究多是在植物组织和细胞中开展[46]。

例如，黄新等[47]利用mRNA差异显示技术研究茉莉酸甲酯对红豆杉细胞mRNA表达的差异。李娟等[48]考察了碳源、氮源、有机成分对HBsAg转基因人参细胞生长和HBsAg表达量的影响。刘峻等[49]研究了真菌诱导子影响人参毛状根总皂苷的合成量。以上研究，虽然距离真正的实现道地药材功能基因的表达和调控尚有一段距离，但为道地药材功能基因表达和调控研究积累了思路和方法。

4 诱导子作用机制及其应用

4.1 诱导子的作用机制

诱导子被植物细胞膜或细胞质中的接受体识别后，细胞膜便开始去极化，引起离子通道的开闭，如Ca2+从环境中流入细胞质，K+和Cl-流出，或者通过 G 蛋白偶联，激活第二信使系统，进一步的扩大这种效应，产生植物防御分子，如钙离子（Ca2+）、活性氧（ROS）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、一氧化氮（NO）、乙烯（ET）等，进而引起下游防卫基因的表达，改变相关酶的活性，并最终导致次级代谢产物的积累，见图1[50]。

4.1.1 细胞内信号分子和作用机制 植物细胞信号分子主要作用偶合各种胞内外刺激，包括生物或者非生物刺激，再通过细胞内信号传导系统使得刺激和细胞间信号级联放大，最终导致相关酶活性的改变，进而引起一系列生理生化反应。例如，诱导子刺激后，细胞质中钙离子（Ca2+） 浓度的升高、一氧化氮合成、活性氧迸发、茉莉酸合成途径激活等，诱导防御基因的开启，刺激代谢途径中关键酶的合成，最终促进植物次级代谢产物的合成[51]。

钙离子：诱导子刺激后，植物细胞在短时间内出现离子流，如Ca2+和H+从环境中流入细胞质，K+和Cl-流出等。这些Ca2+可以驱动钙离子受体钙调蛋白（CaM）的反应，一旦钙调蛋白激活后，可以进一步激活与钙调蛋白相关的蛋白激酶，从而引发蛋白的磷酸化，进而引起防御基因的表达[90]。例如，Ca2+含量迅速上升后，激活钙调蛋白，会使大量的NAD（P）H氧化酶被激活，NADPH氧化酶可以催化过氧化物的产生和积累，从而进一步引起并下游一系列的反应，刺激次级代谢物的积累[52]。Ca2+内流以后，可作为信号分子激活磷脂酸 C，进而使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）水解产生 2 个第二信使： IP3（三磷酸肌醇）和 DAG（甘油二酯）。其中，DAG 可以与蛋白激酶结合，激活蛋白激酶 C，从而触发蛋白磷酸化信号级联，引起细胞内代谢物的积累。IP3 可以与细胞内钙库（如内质网、线粒体、叶绿体、液泡等）上的钙离子通道受体结合，进而动员细胞内钙库中钙离子的释放。IP3-Ca2+信号途径被认为是诱导植物抗毒素产生的调节物质[53]。在长春花悬浮细胞过程中加入真菌粗提物作为诱导子时，IP3信号转导途径被激活，从而进一步使长春花细胞中生物碱的含量提高[54]。

活性氧：植物防御早期的另一个重要变化是活性氧的迸发现象。活性氧浓度升高可以作为第二信使引发胞内一系列抗性反应，如可以促进结构蛋白和木质素的合成使细胞壁增厚，细胞超敏死亡等，另外，活性氧介导的脂质氧化可以刺激茉莉酸及相关化合物的合成，诱导次级代谢防御基因和次生代谢物合成基因的表达，进而诱导次级代谢[55]。在红豆杉细胞培养过程中，经尖孢镰刀菌的细胞壁粗提物诱导后，红豆杉细胞中活性氧大量积累，最终会导致细胞中紫杉醇的含量显著上升，与对照相比提高了近4倍[56]。但是高浓度的活性氧，如 O2-，H2O2，OH-，1O2会损伤细胞内的成分。抗氧化酶体系，如超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化物酶 （POD）以及过氧化氢酶 （CAT）等，会被激活，从而减轻活性氧的毒性作用，增强植物的耐受性[57]。在丹参细胞培养过程中，Dong等[58]发现在丹参细胞培养基中加入水杨酸，酚类化合物的含量会显著增加，同时抗氧化物酶SOD，POD，CAT 的活性也会增加。

茉莉酸类：在许多的植物细胞培养体系中，诱导子都可以诱导内源的茉莉酸类物质的合成，其可作为细胞内和细胞间的信号分子，与转录因子相互作用，进而调节防御基因的表达，最终导致次生代谢物质的合成[59]。茉莉酸类也可以刺激次级代谢产物合成相关的基因的表达，从而促进一系列次级代谢产物的合成，包括萜类物质、黄酮类物质、生物碱和苯丙烷类物质[50]。在贯叶连翘细胞悬浮培养过程中，在培养基中加入黑曲霉细胞壁的粗提物作为诱导子时，茉莉酸的合成量迅速增加，同时细胞中金丝桃素的含量也迅速增加，而加入茉莉酸合成抑制剂后，细胞中金丝桃素的含量显著下降[57]。

一氧化氮和水钏幔涸谧匀唤缰校水杨酸（SA）是植物与病原菌相互作用的诱导物，它能够诱导发病机制相关 （PR） 基因的表达及和致病相关蛋白的产生，但是，水杨酸不是存在于所有植物防御代谢中[1]。研究发现，在部分植物的细胞中，水杨酸的迅速合成，可以诱导一些与代谢相关基因的表达，促使一些次生代谢产物的积累，例如，在茜草的培养过程中，SA可以增加细胞中蒽醌类物质的积累[60]。一氧化氮（NO）作为信号化合物，近年来才逐渐被认识。在植物体内，NO可以通过一氧化氮合成酶（NOS）、硝酸盐还原酶（NR）或者非酶促反应来合成[59]。转录组测序的结果表明，NO处理后，可以引起植物细胞内与压力和抗病性相关的基因的表达，说明了NO信号途径可能与细胞内的次生代谢相关[61]。另外，NO还可以作用于水杨酸（SA）等信号分子的上游，参与和调控植物细胞中SA等信号分子的生物合成[62]。

真菌分泌物T导子是指将真菌的发酵液收集后，用4层纱布进行过滤，1万×g 离心20 min后，用0.4 μm的滤膜进行过滤，用旋转蒸发仪把过滤后的发酵液浓缩到一定体积，放入灭菌锅中121 ℃灭菌25 min。一般将灭活菌体发酵液在一定时间加入植物培养物培养基，处理一定时间来诱导植物培养物的生长以及次级代谢产物的积累。真菌分泌物体作为诱导子在植物组织培养中的应用，见表4。

4.2.3 非生物诱导子在植物组织培养中的应用 水杨酸（SA）和茉莉酸类化合物 [茉莉酸（JA），茉莉酸甲酯（MJ）]由于可以通过诱导多种植物次级代谢产物合成途径中基因的表达来促进次级代谢产物含量的增加而广为人知。除此之外，由于他们可以在低浓度诱导远离他们合成部分的细胞反应，又被成为植物激素。其中，茉莉酸甲酯类应用最广泛，目前已经成功应用于人参、柴胡、百部、甘草、西洋参、匙羹藤、柴胡、紫锥菊、雷公藤、睡茄、刺五加、苦艾和积雪草等植物组织培养中来提高细胞中次级代谢物的含量。

在苦艾悬浮细胞培养中，添加1.0 mg・L-1的茉莉酸以及茉莉酸甲酯可以使其总酚，总黄酮的含量增加，另外，可以提高自由基清除能力[97]。加入10 mg・L-1的茉莉酸甲酯到人参不定根的培养液中，人参皂苷约32 mg・g-1是空白组的4.76倍[98]。

化学合成诱导子一般指的是对已知的诱导子进行改造，通过化学合成，在诱导子分子结构上加入一些官能团等，来提高诱导子的诱导能力，增加药用植物细胞中次级代谢物的积累。其中，最常见的是对茉莉酸甲酯的改造。例如，在三七悬浮细胞的培养过程中加入五氟丙基茉莉酸甲酯、2-羟乙基茉莉酸甲酯以及2-羟基乙氧基乙基，结果发现他们都能显著增加人参皂苷的含量[99]。Qian等[100]考察了2-羟乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯对红豆杉细胞中次级代谢产物的诱导作用，结果发现，2-羟乙基茉莉酸甲酯和三氟乙基茉莉酸甲酯能显著提高红豆杉细胞中紫杉烷C的含量，质量分数分别达到44.3，39.7 mg・g-1，均高于对照组（茉莉酸甲酯处理组）的含量（质量分数分别为14.0，32.4 mg・g-1）。

除了常用的上述这些化合物外，还有一些物理因子如紫外光、温度、超声，金属离子，水分，pH，盐强，气体如臭氧、一氧化氮、过氧化氢、二氧化碳、乙烯等都能提高次级代谢产物的含量。

5 生物合成生产药用植物活性成分

由于生长受到自然环境的影响，许多药用植物生长缓慢或栽培机制复杂。中药材中的活性成分存在含量低、结构复杂、不稳定、很难化学合成或产率地下等缺点。利用生物技术生产活性成分有许多优点：包括生长周期短、生产标准化、质量稳定等，为中药资源保护提供了新的途径。随着生物合成技术在青蒿素、紫杉醇，丹参酮和人参皂苷生物合成研究中的应用，预测生物合成技术将成为中药可持续利用的重要途径之一。近年来利用生物合成来生产活性成分的例子见表5。

药用植物有效成分的生物合成是在基因组学的研究基础上，通过在细胞中构建有效成分的生物合成途径和代谢网络，从而实现药用有效成分的定向、高效的合成，以解决药用有效成分的生产及药物研发等一系列问题[52]。植物组织培养在生物合成中的应用包括功能基因的挖掘和基因功能体内验证。

基因功能基因的挖掘主要是通过转录组测序来实现的。Subramaniyam等[101]对MJ处理不同时间的人参不定根进行了转录组测序，发现30个转录因子，11个GT与人参皂苷合成有关。Nuruzzaman等[102]对MJ处理过的人参不定根以及未处理过的不定根进行测序，发现48个转录因子与人参皂苷的合成相关。Jayakodi等[103]对2种人参材料诱导出的不定根以及栽培人参进行了转录组测序，发现不定根中90%的基因与数据库得到一致，17%的基因是栽培品中所没有的，此外还发现了一些与人参皂苷合成相关的候选功能基因。

基因功能的体内验证主要是通过在植物组织培养器官体内进行基因沉默以及过表达来实现的。Park等[104]通过把CYP716A53v2基因在PCR 8.0中进行克隆，然后与pH2WG连接构建过表达载体，然后导入农杆菌中，侵染人参胚状体，经过筛选得到CYP716A53v2过表达根系；另一方面，把CYP716A53v2基因进行沉默，构建相应的沉默载体导入农杆菌中继而侵染人参胚状体，经过筛选得到CYP716A53v2沉默根系。研究发现，过表达根系中CYP716A53v2基因的表达以及原人参三醇类皂苷含量高于正常根系，沉默根系中CYP716A53v2基因的表达以及原人参三醇类皂苷含量低于正常根系，说明CYP716A53v2基因的功能是转化原人参二醇为原人参三醇。

植物组织培养论文:植物组织培养课程改革与实践研究

摘要：本文把传统的知识教学体系下的《植物组织培养》教学内容进行重构，从教学内容的设计、教学方法与手段以及课程考核等方面进行了改革，突出实践性和技能性，取得了良好的教学效果。

关键词：植物组织培养；教学改革；实践研究

植物组织培养是20 世纪初发展起来的一门新技术，是现代生物技术的重要组成部分，经过几十年的发展已经广泛应用于农业、林业、工业与医药业中，尤其是在苗木脱毒、快速繁殖、新品种培育、植物次生代谢产物的生产等方面发挥着重要的作用，并创造了巨大的经济效益与社会效益[1]，这使得近些年试管苗在国内外市场上已形成产业化，因而需要大量实践能力强的植物组织培养技术技能型人才。《植物组织培养》课程具有很强的专业性和实践性，它对农林类高职学生实践能力、创新能力和创业能力的培养，对产学研结合以及为农业产业和地方经济建设服务具有重要的现实意义[2]。本课程教学围绕植物组织培养工作岗位所需知识、能力及实际工作任务需要，重新构建了教学内容。培养学生掌握培养基成分、功能、无菌操作流程以及提高试管苗成活率措施等知识目标，达到学习仪器使用维护、培养基制备、无菌操作、试管苗移栽等基本能力目标，以及爱岗敬业、热爱组培事业、团队协作的基本素质目标。

1 课程改革的思路

课程组人员通过调研得知，从事植物组织培养工作的学生初次就业从事的工作任务，主要是进行培养基制备（母液配制）、无菌操作及组培苗培养、组培苗的移栽与管理，这也是植物组织培养的核心能力。所以，在进行课程改革的过程中，瞄准组织培养4个典型工作任务，即母液配制、培养基制备、无菌操作及组培苗培养、组培苗的移栽与管理来确定培养目标，对学生技能进行反复熟练、反复强化。在教学内容设计过程中，基于北方园艺果蔬花卉典型工厂化产品马铃薯、蓝莓、蝴蝶兰的生产项目为主体，重构课程内容。培养学生自主获取信息、自主制定工作方案、自主完成组织培养中的典型工作任务、并能够对过程进行检查。总体思路为“一抓，二做，三融入”，即教师抓1个典型的项目，学生做2个典型的任务，融入理论、科研和大赛。内容设计从简单到复杂至再提升的三级教学目标。

2 课程内容的设计

本课程把以往按照章节讲授绪论、实验室的构建和操作技术等七章内容，按照典型工作任务和典型生产项目把相关的内容进行整合，结合本专业的特点设计4个大的项目，9个子项目（见表1），规避了以往专业性不强，学生操作能力弱，教学内容重复的弊端，教师在每类大项目中讲解一个子项目，在教师指导下学生完成第二个子项目，学生自主完成第三个子项目，并提交项目成果。拓展项目不占用课内学时，教学内容设计重复的是步骤，而不是内容，难度增加，能力逐渐递进。

3 教学方法与手段改革

本门课程在实施过程中围绕蓝莓、蝴蝶兰、马铃薯，采用项目教学、任务驱动、真岗实练等教学方法，以及多媒体教学、现场教学、课上课下相结合等教学手段。在教学过程中，利用QQ群、微信发任务，学生利用课余时间自主预习和准备教师发放的资料及任务清单，各个小组根据任务清单内容自己准备用具并清洗干净。课内教学，首先教师利用多媒体教学讲解基本知识点、重点和难点，利用网络教学播放视频资料，用示范教学法教师演示标准的操作技能。然后进入实操环节发放生产任务单和考核标准。采用小组讨论、任务启发的方法让学生填写生产任务单，教师检查正确后开始进行操作，操作过程参照详细的考核标准。整个实操环节教师在现场进行巡回指导，并纠正学生操作过程中出现的技术问题，要对本次课程进行总结与评价，学生小组互评需要改M的方面，教师进行总结，指出在本次课程中出现的问题。课后拓展采用上届带下届的方式，成立课外兴趣小组进行相关内容的课后任务。

4 课程考核

对于课程的总体考核采用理论考核+过程考核+大赛模拟考核的方式进行，要想技能有提升，理论知识必须要扎实，理论考核占总成绩的30%，主要考核植物组织培养基础的知识和技能点。过程考核中包括平时成绩、项目成果、现场操作三部分，平时成绩占总成绩10%，主要包括出勤、提问发言、实训准备等，每个项目的成果占总成绩的20%，每个项目最终要提交成活的试管苗、项目总结报告。现场操作占总成绩的20%，主要是小组互评和教师评价，以教师评价为主。大赛模拟是按照国赛“植物组织培养”赛项的标准和要求进行，主要有三部分内容：MS母液配制、MS培养基制备、马铃薯组培苗的继代培养，成绩占总成绩的20%。

作者简介：张彩玲，硕士，副教授，研究方向：植物组织培养。

植物组织培养论文:论植物组织培养褐变产生的因素及对策

摘要:本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依据。

关键词:植物组织培养，褐变，对策

目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。

1褐变产生的影响因素

影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。

1.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。

1.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。

1.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。

1.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。

2褐变产生的机理

2.1非酶促褐变

非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。

2.2酶促褐变

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。

在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，形成黑褐色物质，从而引起褐变。

3防止外植体产生褐变的对策

从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。

3.1适当外植体的选择

取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。

3.2对外植体的处理

通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。

3.3适宜的培养基

培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。

3.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。

3.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。

3.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。

3.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。

3.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。

3.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。

3.4添加褐变抑制剂和吸附剂

褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。

常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面

影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。3.5进行细胞筛选和多次转移

在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。

植物组织培养论文:高校植物组织培养实验管理模式

摘要：高校植物组织培养实验所应用的实验工具和仪器设备较多，实验存在一定的危险性。加强对实验的管理不仅能够提高学生的实际操作能力，也能在很大程度上降低实验的危险性。对高校植物组织培养实验的管理模式进行探究，希望为今后的实验管理工作提供理论上的支持。

关键词：高校；植物组织培养实验；管理模式

植物组织培养实验是生命科学专业的重要实验之一，该实验能够培养学生的应用能力和思考能力，在实验课程中占据重要的位置。植物组织培养实验作为一项综合性的实验，所要应用到的化学实剂、工具和实验设备较多，其中不乏有毒有害、易燃易爆的物质和高温高压的设备工具，如果操作不当很容易发生危险，因此，必须加强对实验的管理，提高实验的完整性和安全性，保障实验的顺利进行。

1建立完善的实验管理制度

在实验开始之前，建立完善的管理制度，为实验的进行提供保障。根据植物组织培养实验的特点，可以建立组织培养室开放制度、仪器使用制度、药品管理制度、安全制度、器皿清洗制度、登记制度、培训制度、消毒灭菌制度以及管理人员责任制度等，保障实验的顺利开展和有序进行。如在学期开始时，实验教师可以为学生安排一次培训，为学生讲解本学期需要完成的实验以及在实验过程中有哪些注意事项。安排学生参观实验室，使学生了解实验的内容和实验室的规章制度，从而更好地投入到实验学习中。

2加强实验过程的管理

2.1实验室的使用管理

由于不同的实验教师对实验的要求有所不同，其需要的实验条件也有着很大的差别，而实验室的空间和资源有限，实验条件无法满足每一位教师的要求。这就要求实验技术管理人员对实验室做出合理的安排，解决好实验过程中出现的各种矛盾，提高实验室的利用率，将实验室的作用发挥到较大。在具体的管理工作中，可在实验室门口张贴看板，详细记录实验室的使用情况和实验室内部的各项参数，如光照情况、湿度、温度等。也可以人为地创造实验条件，如需要暗室培养时，可用遮光板将实验室遮挡起来，人为创造一间暗室；在进行梯度培养时，由于所需的培养空间较小，可以使用培养箱来完成培养。将培养箱摆放在实验室外的走廊上，扩展实验室的使用空间，提高实验室的使用率。同时也要根据教师和学生的时间灵活安排实验，利用好实验室的空当，将实验室的作用发挥到较大。

2.2仪器设备的管理

组织培养实验室的设备具有种类多、使用频率高的特点，如果没有进行妥善的管理，很容易造成使用上的混乱，影响实验的正常开展，因此，必须加强对实验室仪器设备的管理，提高设备的利用率。在管理中，首先技术管理人员要定期对设备进行检查，确保设备的性能处于正常的状态，一旦发现设备故障，及时进行维修或更换，避免延误实验。其次，技术管理人员要做好设备的保养工作，按照使用说明定期对设备进行保养，延长设备的使用时间。另外，技术管理人员还要完成实验室的清洁工作，保护实验环境。每周对实验室地面和台面进行消毒，每2个月清洗空调过滤网，保障实验能够在无菌的条件下开展。

2.3预备实验的管理

由于植物组织培养实验所应用到的实验药品较多，工作量较大，因此，在实验开始之前，要充分做好准备工作。首先，将培养基药品和其它药品分开存放。培养基药品包括微量元素、无机盐、有机盐以及激素类药品，在存放上可以根据药品的存放条件将这些药品分柜存放，以免在取用时出现混乱。除培养基药品外的其它药品可按照其形态进行分类存放，将固体药品和液体药品来分，在每一种形态的药品中又包含酸、碱、盐、氧化物等不同性质的药品，这些药品的存放也要做到区别对待。对于危险性较大的化学药品，可采用双人双锁的管理制度，以此来保障药品的安全。对于一些常用实剂，如1mol/L的KOH溶液和HCL溶液来说，要安排专门的人员进行管理，定期完成溶液的配制工作。对于高压灭菌锅等数量较少的设备，可以进行登记管理，也可安排多人同时进行实验，提高实验设备的使用效率。

2.4实验进行时管理

在学生完成实验的过程中，教师要对其进行完整的监督和管理，既要保障实验的质量，又要确保实验的安全。在这一过程中，首先，要加强对学生的安全教育，提高学生的安全意识，使其了解到危险药品所能带来的危害，从根本上保障实验的安全性。其次，教师要让学生明确实验的流程，严格按照领用制度进行实验用品的领用，保障实验能够有序进行。反复确认危险药品的用途和用量，确保实验的安全。另外，教师要确保每一个学生了解实验操作规范，加强防范，采取必要的安全措施来保障学生的安全。保障实验室防火、防漏器具的完整性，建立危险品记录制度。

3积极改善实验的环境

3.1加强教师队伍的建设

教师队伍承担着教学和管理的任务，在实验过程中起到了至关重要的作用，因此，必须不断提升教师的素质，使其更好地参与到植物组织实验的教学和管理工作中去。由于实验教学所涉及到的内容较多，教学过程相对复杂，因此，教师必须要具备专业的素质，完整的掌握实验知识，保障教学的质量。高校也要加强对教师的培训，使其不断更新自己所掌握的知识，更好地完成教学工作。在培训的过程中，高校要做到以下几点：一是有计划地安排教师进行外出学习，使其能够掌握先进的教学理念和教学知识，使教学工作能够不断获得进步。二是优化教学工作者的年龄构成，加强对年轻教师的培训，提高双师型教师的比例，优化教师队伍的构成。三是加强对教师技术上的培训，如安排教师到设备公司完成设备知识的学习，以这种方式来提高教师的实际操作能力，提高设备的利用率。四是为教师搭建交流的平台，使其能够看到他人具备的优势，看清自身的不足，从而激励教师不断进行自我提升。五是开展学术交流会，聘请的教育工作者来校进行讲座，使教师对当前的教学现状有所了解，不断提高实验教学的质量。

3.2构建学生交流平台

组织培养实验具有实验步骤复杂、实验周期长等特点，在操作上具有一定的难度。不论哪一个实验步骤出现问题，都会对实验结果造成巨大的影响，不仅会影响实验的进度，也会造成资源上的大量浪费。构建实验交流平台能够使学生更加深入了解实验步骤，掌握实验的方法，减少错误的发生，达到事半功倍的效果。在具体实施上，可以定期组织学生进行学术交流，在学术交流过程中，教师要利用多媒体设备为学生展示实验的过程和实验中所要注意的事项，使学生更加直观了解实验的步骤，吸取前人的经验和教训。教师也可以让学生阅读中外文献，了解国内外的实验进展情况，让学生在学术交流会上完成交流，同时提出自己的问题，由教师统一解答。这种方式扩展了学生的视野，推动实验工作的进一步发展。

3.3开放组织培养实验室

将组织培养实验室向学生（特别是本科生）开放，不仅能够为学生实习实践提供更好的物质条件，也为学生创建了一个良好的学习空间。学生在完成课题研究的同时，也能够完成学习任务，达到了实验学习的目的。实践表明，实验室可以通过以下几种模式向学生开放：3.3.1向所承担的实验课题开放。在这一过程中，教师可以借鉴国外的导师制度，让学生依靠自己的能力完成相关课题的研究，提高学生的思考能力和实际操作能力。学生通过自己收集资料、查阅文献，解决了相关问题，掌握正确的学习方法。另外，学生所得出的实验数据也为教师提供了一些基础性的研究参考，对教师的工作有很大帮助。目前，很多高校已经开始实行一体化教学，将理论教学与实践教学结合在一起，这种方式不仅激发了学生主动学习的热情，也使学生的主观能动性得到培养。3.3.2向毕业论文开放。毕业论文是教学的重要组成部分，也是检验学生实际能力的一种重要方式。如果学生的毕业论文涉及到植物组织培养的相关内容，教师可以向其开放实验室。在此过程中，教师可对学生进行实验的前期指导，帮助学生找到适当的方法，为学生提供便利的条件，使学生能够更好的完成实验操作，保障毕业论文的质量。3.3.3要将实验室向兴趣小组开放。很多学生对实验学习抱有很大的兴趣，对于这样的学生，教师可以让其组成实验兴趣小组，一同完成数据收集、材料准备以及实验操作等工作。实验教师可以担任兴趣小组的指导教师，同时选择能力较强的学生担任小组长。在教师的指导下，学生通过查阅文献确定自己的实验项目，自己设计实验过程。将所要进行的实验高职实验室管理教师，在得到教师的同意后方可开始实验。在实验的过程中，小组成员可就实验中遇到的问题展开讨论，找到正确的解决办法，如果以个人的能力无法解决相关问题，可向指导教师进行咨询。这样一来，学生获得了自主学习的空间，其钻研、创新的精神也得到了很好的培养。3.3.4要为参赛学生开放实验室。学生在校学习的过程中会面临很多参赛的机会，这些比赛能够锻炼学生的能力，提高学生学习兴趣，因此，高校要为参加比赛的学生提供实验条件，使学生完成参赛前的准备工作。在这一过程中，高校可为学生安排专业较强的实验教师作为其指导教师，帮助学生解决实验过程中遇到的问题，对学生的实验行为进行指导，保障实验操作的标准性和实验的性。在实验学习的过程中，教师也可以让学生以小组为单位进行比赛，丰富教学的形式，提高学生的学习兴趣。

4结语

植物组织培养实验作为生命科学专业的重要实验，具有实验过程复杂、实验药品众多的特点，因此必须加强对实验的管理，提高实验的效率。在管理中，要建立完善的管理制度、加强对实验过程的管理、搭建完善的交流平台、保障实验合理有序的进行以及保障实验的效果。

作者：张俊琦 单位：北京林业大学公共分析测实中心

植物组织培养论文:千里香植物组织培养的优化

摘 要：千里香为我国较常见的药用植物，有麻醉止痛，消肿解毒等功效。本实验以其新生幼叶及茎段为外植体，通过优化组织培养方法，筛选出适宜千里香生长的培养基体系，其中生长素的种类及含量对外植体的生长具有重要作用，同时，一定浓度的活性炭也可以有效地预防愈伤组织的褐化。经大量试验发现适合千里香生长的培养基为：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次实验旨在为千里香的无土大面积栽培提供新的方法和途径，同时也为千里香在分子水平的研究提供无菌材料。

关键词：千里香；组织培养；优化；生长素

基金项目：广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族医学院校级课题。

千里香（Murraya paniculata）又名七里香、万里香，为芸香科（Rutaceae）九里香属（Murraya）植物，原名小叶九里香，1978年黄成就将小叶九里香上升为种，更名为千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而广泛分布于我国的广西、云南等高海拔温热潮湿地区，植物体为常绿灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多种功效，是我国较常用的中草药材。国内外学者对千里香的研究较少，且多见于对其化学组份以及药理作用的探索，D.P. Chakraborty等人发现千里香植物体内含有一种新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人从千里香的叶子中提取了两种氧甲基黄酮，具有抗菌消炎作用[3]；闫江红等人利用HPLC法对千里香叶片中黄酮类成分含量进行了测定[4]。人们对该材料进行药理分析的同时，对其组织培养方面以及分子蛋白水平的研究甚少，国内外暂时还没有千里香植物组织培养的相关文献，通过本次实验，旨在为千里香进一步的分子水平以及蛋白水平研究提供无菌材料，提高其实验性和成功率，同时，也为植物组织培养技术提供新的方法和途径。

1材料采集

于2016年8月选择晴朗天气在广西省百色市境内进行材料的采集，选择生长健壮、污染较少、无病害的千里香植株，采摘带腋芽的茎段、带小叶柄的叶轴以及幼叶作为培养材料。

2方法

2.1外植w处理

将采集的实验材料用无菌水冲洗8min。其中带叶小柄的叶轴和带腋芽的茎段分割成长约1cm的茎段，嫩叶边缘全部剪掉，以便愈伤组织的生长，留下叶子的中心部分，约占原有叶子面积的一半以上。

2.2外植体消毒

将预处理好的外植体放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速转入10%的次氯酸钠溶液消毒3min，然后用无菌水冲洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用无菌水冲洗5次，将消毒后的外植体放在无菌滤纸上吸干表面水分后接种在胚芽诱导培养基中。

2.3培养基配置

诱导芽生长培养基

MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖

增殖培养基

（1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖

（3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

（4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L

2.4愈伤组织培养

初代外植体接种于诱导培养基中，培养条件为温度为26℃，光照16h，黑暗8h，光强为2500lx的培养箱中培养，定期观察和记录外植体的生长及变化。

2.5 6-BA浓度梯度试验

将长势一致、诱导良好的外植体分别转入不同浓度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培养基（1）中培养，每浓度试验10瓶，培养30d。

2.6活性炭试验

将诱导良好的外植体分别移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培养基中（2、3增殖培养基），进行抑制褐化实验，每种培养基实验10瓶，培养15d，观察有无活性炭对外植体褐化影响。

2.7生长素种类试验

挑选长势好的材料放入含有一定浓度的IBA生长素的培养基中培养（4），每种接种10瓶，周期30d，与其他生长素进行对比。

3 结果与分析

3.1 不同6-BA浓度对愈伤组织的影响

6-BA为植物组织培养常用的细胞分裂素，可以有效促进细胞进行分裂，经过查阅相关文献发现植物在组织培养过程中，该生长素的使用含量差异较大，例如林茜等人对四数九里香植物组织进行培养过程中[5]，6-BA增长浓度为1.0mg/L。王小敏等人在两面针的组织培养与快速繁殖中[6]，6--BA的增长浓度为2.0mg/L，因而本实验利用不同的浓度梯度培养，最终筛选出最适宜千里香生长的6-BA浓度为2.5mg/L。由表1可知，当外植处于不同浓度的6-BA培养基时，外植体均可长出愈伤组织，而当6-BA浓度为2.5mg/L时，培养基的发芽率较高，当6-BA浓度大于或者小于该浓度时，培养基的发芽率均明显下降，因而，2.5mg/L6-BA浓度为最适宜培养千里香的浓度。

3.2 不同生长素种类对愈伤组织的影响

NAA、IBA均为植物组织培养常用的生长素，通过实验对比，外植体处于不同培养基中发芽率略有不同，由表2可知，当外植体处于含有生长素NAA的MS培养基中，发芽率优于含生长素IBA的培养基，分析原因可能是INA促进愈伤组织生根，尤其是不定根的生长，以及外植体的生长效果等方面略低于生长素NAA。

x3.3 活性炭（AC）对愈伤组织褐化的影响

实验发现，在千里香组织培养的各个时间段均有褐化的现象发生，这在一定程度上影响了千里香的生长，有实验表明，褐化的发生及褐化程度对外植体的生长有一定的影响[7]，其中相对较大的材料褐化程度较轻，而较小的材料更容易发生褐化[8]。有报道称，低浓度下的活性炭可以吸附培养基中的多酚氧化物及有毒物质，所以可以有效地防止外植体的褐化[9]。通过比较有无活性炭发现，当添加0.5mg/L的活性炭时，可以很好的抑制外植体褐化（图1和图2）。

3.4 温度和光照对愈伤组织的影响

有研究发现，低温条件可明显降低褐化率，而高温培养却促进褐化的发生，当温度较高时褐化率达52.7%[10]。但千里香适宜在温热潮湿的环境中生长，因而，选择的组织培养温度为26℃，外植体的褐化率较低，同时也符合千里香的生L环境。

培养光照不适亦对外植体的生长产生影响，赵伶俐等人研究结果表明，2000lx光强培养的外植体褐化率较严重，1000lx和3000lx光强培养可降低外植体的褐化率[11]，因而，本次实验选择2500lx光强，既可以有效降低褐化率也可以促进外植体生长。

4 结语

现代植物组织培养较常用的生长素包括6-BA、NAA、IBA，其中6-BA可促进外植体的腋芽伸长生长，NAA可促进外植体的生根，本次实验筛选出适宜千里香外植体进行组织培养的生长素浓度为6-BA2.5mg/L、NAA0.5mg/L，同时，也验证了活性炭可有效抑制外植体发生褐化反应，增加植物体的成活率，因而较为适宜千里香组织培养的培养基为MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5mg/L。千里香是我国的一味中草药材，有行气活血、解毒消肿、散瘀止痛等功效，但人们主要研究其化学组成，至今还没有看到相关组织培养的文献，通过本次实验，筛选出千里香较为适宜的外植体生长环境，将为千里香的无土栽培和进一步的分子实验提供材料，也为其他植物的组织培养提供参考。

作者简介：徐红红（1988.03），女，黑龙江省鹤岗人，硕士，助教，从事千里香组织培养及遗传转化工作。Emall：

通讯作者：潘永玖，Emall：

植物组织培养论文:我国木兰科植物组织培养研究进展

摘要：文章论述了木兰科植物组织培养研究的进展，对相关工作人员工作的开展有一定借鉴意义。

关键词：木兰科；基本培养基；诱导生根

木兰科（Magnoliaceae）植物是世界著名的观赏园林绿化植物，有些树种亦是我国传统的中药材。木兰科属种资源丰富，全世界共有15属250种，其中我国自然分布有11属130种，占世界总属的37%，总种的52%，居世界各国的首位[1]。木兰科植物在系统发育中是一个最古老的类群，在被子植物中受到的威胁最多，是探索被子植物起源、发展和建立被子植物自然系统不可缺少的材料[2，23]。随着实际应用的发展，木兰科植物种质资源越来越欠缺，有30多种已被列入我国珍惜濒危保护植物的名单之中[16]。所以越来越多的科学工作者关注木兰科属种资源的保护和资源开发问题。生物技术的发展，无疑给木兰科植物的种质保存提供了非常好的理论基础，有不少人开始利用组织培养技术进行木兰科植物的种质保存和资源开发[3-8，10-15]。但大部分尚处于初步探索阶段，根据资料记载，由组织培养诱导不定芽成功的仅在二乔玉兰（Magnolia soulangeana）[8，17]、白玉兰（Magnolia denudata）[7，32-33]、广玉兰（Magnolia grandiflova）[11，17，37]、荷花玉兰（Magnolia grandiflor L.）[22]、紫玉兰（Magnolia liliflora Desr）[24-33]、天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）[38]、凹叶厚朴[Maganolia biloba (Rehd et Wlis)Cheng][5]、川厚朴(Magnolia officinalia Rehd et Wils)[18]、巴东木莲(Manglietia patungensis Hu)[20]、深山含笑（Michelia maudiae Dunn.）[6]、金叶含笑（Michelia foveolara Merr.et Dandy）[17]、长蕊含笑(Michelia longistamina)[17]、阔瓣含笑(M.Platypetala Hand-Mazz.)[17]、峨眉含笑(Michelia wilsonii)[17]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、火力楠（Michelia macclurei）[10，17]、乐东拟单性木兰[Parakmeria lotungensis（Chun et C.Tsong）Law][17，21]、云南拟单性木兰（Parakmeria yunnanensis Hu）[36]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]、北美鹅掌楸（Liriode ndron tiliptera）[17]、鹅掌楸（Liriodendron chinense Sarg.）[12，15，17]、杂交鹅掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[4，13，14，17，39]等几十个种有报道，但经愈伤组织或不定芽诱导生根的成功例子仅在鹅掌楸（Liriadeadron chinease Hemsi Sarg）[12、15]、杂交鹅掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[39]、白玉兰（Michelia alba）[7]、紫玉兰（Magnolia liliflora Desr）[24]、云南拟单性木兰[36]、巴东木莲(Manglietia patungensis Hu)[3，20]、深山含笑（Michelia maudiae）[6]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]等极少树种中有报道，而愈伤组织内次级代谢产物的研究分析未见有报道，见表1。本文就木兰科植物组织培养的研究现状做一综述。

1 基本培养基和外植体的选择

木兰科植物都是木本或木质藤本，所以在外植体的选择上常用顶芽、腋芽、嫩茎段，而叶、叶柄、托叶等外植体在脱分化并诱导愈伤组织产生上效果并不佳。一般而言，芽诱导产生愈伤组织的能力最强，而叶柄次之，叶片低。这在鹅掌楸属[4，12，14，17，39]、含笑属[6，25，34]、木兰属[24，31]等的研究结果是一致的。在荷花玉兰的组织培养[22]中发现，花托产生的愈伤组织紧密肿胀，诱导率较高，叶芽次之，而雄蕊、雌蕊及花被片不易产生愈伤组织。这一点可以启迪我们在其他属的外植体选择上可以拓开思路。王碧琴对7种木兰科植物进行组织培养，研究结果认为：越是幼嫩的组织部分，越易形成愈伤组织，同时，易产生愈伤组织的外植体，很难分化出不定芽，所以在外植体的选取上，要从实际需要出发，根据植物个体性状，做具体选择，对于诱导不定芽，苗质组织较疏松的外植体，稍微取成熟部位并要多留茎节及生长点[17]。

合适的基本培养基是组织培养成功的一个重要因素，不同植物培养所要求的基本培养基有差异。目前植物培养采用的基本培养基主要为MS、B5、WPM、1/2MS等，每种培养基中盐浓度不同，培养基中盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有影响。由表1可看出，木兰科鹅掌楸属植物的组织培养80%以上采用MS或改良的1/2MS，此外，WPM、1/2WPM、改良的Risser和White培养基也适合鹅掌楸的组织培养[12，14]。含笑属植物的组织培养常采用MS[6，25，34]，生根时采用1/2MS或1/4MS。木兰属组培[5，7，18，22，24，31，32]中常用B5、MS培养基，在根的诱导上用1/2B5、、1/2MS或1/4MS，说明适当降低基本培养基中矿质离子的质量浓度有利于根的产生和生长。

2 培养基配比对愈伤组织产生的影响

2.1 植物生长调节剂物质

基本培养基提供给外植体最基本的物质条件，使外植体生存并保持低的生理活性，而植物生长调节剂能诱导细胞分裂、愈伤组织生长以及根芽的分化，常用的植物生长调节剂有：生长素类和细胞分裂素类。生长素类的主要作用是启动有丝分裂，恢复植物细胞的分裂能力，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。细胞分裂素主要作用是促进细胞分裂和扩大，诱导芽的分化、侧芽的萌发生长而抑制茎的伸长，使茎增粗，常用的细胞分裂素有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）等。细胞分裂素和生长素常配合使用，使外植体生长和诱导效果更强。一般而言，植物生长激素通常被用来诱导愈伤组织形成和增殖，植物的生根多数是用生长素单独实现。而愈伤组织产生后的增殖、分化再生植株或诱导细胞胚时，生长素应相应降低浓度或祛除，而细胞分裂素浓度适当提高。植物组织培养的器官发生途径可分为：直接器官发生途径和间接器官发生途径，前者是指以芽或带芽茎段直接诱导不定芽然后得再生植物，后者是指外植体经愈伤组织再诱导芽的再生途径[3]。不同的器官发生途径，在激素的选择上有所不同。孙雁霞等[18]对川厚朴愈伤组织培养的研究中未用到6-BA，只用2，4-D和NAA，因其主要针对愈伤组织的增殖，所以没有用到细胞分裂素。王琪[22]利用荷花玉兰的花托和叶芽诱导愈伤组织，发现：2，4-D+NAA+IAA/6-BA的比值越大，愈伤组织诱导率越高，生长量越大。而刘贤旺等[5]对凹叶厚朴组织培养试验中利用较高浓度的2，4-D（2mg/L）和较低浓度的6-BA（1mg/L）诱导愈伤组织的产生，愈伤组织的生长则适当降低2，4-D的质量浓度（1.0mg/L），提高6-BA的质量浓度（1.5mg/L）。在不定芽诱导后的增殖中，醉香含笑[34]、五味子[19]提高生长素/细胞分裂素的比值对不定芽有明显的增殖效果，这与刘贤旺的愈伤组织增殖所需的激素配比恰恰相反。田敏[4]对杂交鹅掌楸的研究结果表明：高质量浓度的6-BA（2.0-4.0mg/L）能促进愈伤组织形成与不定芽的分化，蒋泽平等人[39]的研究结果与之相同，在其他因子不变的情况下，细胞分裂素所含质量浓度愈高，启动越快，丛生芽也较多，由此看来细胞分裂素是诱导外植体脱分化和直接器官发生的关键因子。纵观表1的实验结果，激素的配比是因植物种类而异的，不可一概而论，而且激素配比是组织培养关键因素，在基本原理的指导下，我们只有通过不断的摸索才能筛选出的配比。木兰科植物组织培养常用的激素种类有：2，4-D、NAA、6-BA等。浓度范围分别为：2，4-D（0.1，1-3mg/L）、NAA（0.02-0.5mg/L，4mg/L）、6-BA（1-3mg/L）。王琪在荷花玉兰组织培养中NAA的应用达到4mg/L。此外IAA、KT、ZT、TDZ、BAP、IBA对木兰科植物也是有效的生长调节物质，据报道，TDZ对木本植物组织培养来说最有效，已经应用于多种木本植物组织培养体系的建立[39，26，27]。

2.2 非植物生长调节物质

在基本培养基中除加入一定配比的植物生长调节物质外，还常加入一些非植物生长调节物质，如营养物质椰乳、水解乳蛋白、谷氨酰氨、苹果汁、香蕉汁、豆芽汁等。木兰科珍稀濒危植物巴东木莲在丛生芽的诱导时添加了10%的椰乳[3，20]，形成丛生芽苗，而未加椰乳的培养基中仅少数能丛生芽苗。刘贤旺比较了豆粉、水解乳蛋白、苹果汁、香蕉汁、豆芽汁5种天然附加物对凹叶厚朴愈伤组织生长的影响，发现在培养基中添加10%豆芽汁能迅速促进愈伤组织生长。Civinova-B在研究树木茎段培养时发现，加入天冬酰胺和谷氨酰胺能提高愈伤组织分化为芽的比率[44]。

3 诱导生根

木兰科植物在愈伤组织诱导、不定芽产生、生根方面均较难[6，7，9]。以快速繁殖为目的的植物组织培养，诱导生根后方可用于工厂化快繁生产。木兰科植物的组织培养只有含笑属、木兰属、鹅掌楸属等几个属的树种有成功诱导生根的报道。陈金慧对鹅掌楸组培苗的生根及移栽技术研究结果表明：适当降低矿质元素的1/2MS培养基，附加IBA0.1mg/L生根效果较好，同时活性碳的使用可以有效提高组培苗的生根率。另外，生根能力随所采集外植体的母本植物的年龄增加而下降。而蔡桁等对鹅掌楸组织培养技术研究结果表明：在生根培养中，以基本培养基WPM或1/2WPM添加NAA1.0mg/L好，而在1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+ABT0.1mg/L组合的培养基的生根率为60%。在以WPM或1/2WPM为基本培养基进行生根培养时，必须采用24h光照培养或先暗处理7-14天再用24h光照培养。由此看来，在鹅掌楸的生根培养中，选择合适的生长素类物质及浓度，适当降低基本培养基的矿质元素，控制好光照是鹅掌楸试管苗生根要重点考虑的因素，此外，活性炭的使用，吸收了培养基中的有毒物质，防止褐变，也能大大提高生根率。乐东拟单性木兰在1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L的培养基上，添加15g/L活性炭有利于生根[21]。楮建民在白玉兰离体培养和快速繁殖中用到的生根培养基为：1/2B5+NAA0.5mg/L+AC1.0mg/L+VB20mg/L[7]。曾宋君在对深山含笑进行快速繁殖时认为：试管内小苗在1/2MS+NAA0.5mg/L的培养基上生根壮苗效果较好。周鑫对五味子组织培养中，生根培养基加入吲哚丁酸2mg/L，由此看来，适当降低培养基中的矿质浓度，添加适量的生长素类激素和活性炭有利于木兰科植物试管苗的生根。而在巴东木莲[20]生根诱导时除了以上条件的满足外，还添加了BA0.05mg/L，但这种情况在木兰科其他植物中不常见。

4 木兰科植物组织培养中常见问题

木兰科植物体内含有较多的酚类化合物，由于褐变引起组织培养失败，已成为快速繁殖体系建立的一大障碍。褐变产生的原因与植物种类、基因型、外植体部位、生理状态、培养基成分及培养条件等有关[42]，此外，接种中外植体大小与褐变也有关系，有报道[43]：当茎尖小于5mm时褐变严重，而7-15mm较轻。对褐化现象的机理研究及解决的方法等有较多的文献报道。目前普遍认为褐变的机理有两类：非酶促褐变和酶促褐变。非酶促褐变，不涉及酶类物质的产生，当细胞适应了胁迫环境就不在发生褐变[8]。酶促褐变是植物组织培养中褐变的主要因素，酶促褐变的发生必须具备3个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸转氨酶，引起褐变的底物主要是酚类化合物。苏梦云对乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究表明：抗氧化剂控制褐变的效果比吸附剂好，以抗坏血酸好，其次是巯乙醇和二硫苏糖醇[21]。参照已有的控制褐变的文献报道，对于木兰科植物在组织培养中出现的褐变问题提出以下几点建议：春季取外植体，外植体以顶芽好；在抗氧化剂溶液中切割、剥离外植体，尽可能减少伤口切割面积；对外植体进行低温冷藏处理；选用专门的木本植物培养基如WPM，或降低基本培养基中的无机盐浓度，如采用1/2MS；初期培养可在黑暗或弱光下进行；在培养基中加入适量的抗褐变剂或吸附剂，如：抗坏血酸、植酸、硫代硫酸钠、硝酸银、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等；在培养过程中进行细胞筛选或多次转瓶。

5 木兰科植物组织培养的前景展望

木兰科是研究被子植物系统演化非常重要的科，其植物资源的多样性是系统理论研究的基础。此外，在实际应用中，其许多植物在医药、化工、园林等方面有着广阔的应用前景。而木兰科大多为木本，稀藤本，分布区域狭窄，采种困难，扦插嫁接成活率不高，资源保护和开发比草本植物难度要大。利用组织和细胞培养技术可以对木兰科植物进行快速繁殖、药物生产、新品种开发等。如鹅掌楸、白玉兰等植物已建立了较好的快繁体系，但大多数木兰科植物还在摸索阶段。姜长阳利用γ射线结合组织培养，选育出了一年开两次花，生长快，抗逆性强的玉兰新品系[30]，为园林绿化植物增添了亮丽的一色。通过组织和细胞培养生产次生代谢产物，已在人参、硬紫草上实现了工业化。西洋参、长春花、雪莲、红豆杉、青蒿等植物通过细胞培养生产次生代谢产物方兴未艾。木兰科植物利用组织和细胞培养生产药物的研究起步较晚，童再康进行了厚朴组织培养和高产细胞系建立的研究，比较了不同愈伤组织内的酚类物质含量[30]。木兰科植物利用组织和细胞培养生产药物和香料等方面值得我们不断深入研究。

作者简介：刘叶蔓（1975-），女，湖南新化人，湖南中医药大学讲师，研究方向：药用植物生物技术的研究。

植物组织培养论文:开展植物组织培养校本课程的实践探索

摘要：校本课程的实施，给学校教师带来很大的自主性、积极性，与此同时，校本课程开发和实施的过程，也给教师也带来一定的挑战。本文以本校开展的植物组织培养研习课程为例，着重探讨其开展过程是如何促进生物教师的专业发展的。

关键词：校本课程植物的组织培养　生物教师的专业发展

“素质教育”从上世纪90年代就提出了，到21世纪又提出了“教育创新”，这使我们的教育观念、教学内容、教育手段等诸多方面发生了重大变化。为适应新课程的需要，我校投资近30万元，改建了植物组织培养室，总面积虽然只有70平方米，但实验室的仪器配置都是很先进的，可以说麻雀虽小五脏俱全，能够达到对学生进行研究性学习的教育、教学实验操作平台，为学生提供了非常好的实验基地。2005年9月植物组培室正式启用，我校生物学科面对新课程改革的需要与时俱进，积极开展了植物的组织培养校本课程的探索实践。

一、植物组织培养研习课程的实践探索

植物组织培养是一种在细胞水平上进行的生物工程技术。它是指离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在无菌条件下利用人为设计制备的培养基，培养在人工控制的环境里，使其再生形成完整的植株、细胞或其它次生物质的一种技术方法。近年来，植物组织培养作为生物工程中的一项高新技术，它有高科技、高效益、高密度的特点，在一个较小的空间，用很少的外植体培养出大量的植株或物质，因而获得很高的经济效益。这在生产实践和科研实验中已被广为采用，并引起社会各界的广泛重视。

植物的组织培养课程的开设能让学生早日了解和掌握一些先进的生物技术，在学习、参与探究和解决问题的过程中，养成严谨的治学态度、一定的科学研究能力和素养。这对于提高学生的生物学素质、形成科技志向、训练可持续发展能力均具有重要的现实意义。

二、由植物组织培养课程实践所引起的认识与思考

就本质而言，一般的校本课程开发的价值追求有三方面：学生个性的发展、教师专业的成长、学校特色的形成。这就是说，校本课程开发本身就是教师专业发展的有效途径之一，下面就植物组织培养课程的开展，探讨它在技能领域、精神领域、知识领域这三个方面是如何促进生物教师的专业发展的。

1.校本课程的开发提高了教师的课程能力和研究能力。

(1)课程能力

植物的组织培养技术是近几年出现的研习课程，有的重点中学开展了很多年，他们有了很丰富的经验。而我校则是刚刚接触此项课程，毫无经验可循。我们教师要自己确定课程目标、课程内容，还要负责课程实施、课程评估，因而必然有助于提高教师的课程能力。

①制定课程目标的能力

我们主要是通过对学生需求、学校环境、自身能力等3个方面的分析来确定课程目标的。因为是刚刚开展组培课程，组培过程、仪器操作我们也都不熟悉，所以我们把目标定在初级阶段，进行初步探索：

Ｉ.初步实验动手能力，如配制培养基母液、灭菌、仪器使用等基本技能，培养实验的基本动手能力和科学技能。

Ⅱ.初步培养文献检索的能力。

Ⅲ.初步学会设计培养基配方，培养信息综合能力。

Ⅳ.初步培养发现问题、分析问题、在一定程度上解决问题和创新思维能力。

Ｖ.学习与他人进行小组合作，培养合作交流能力。

研习课程开展的时间长了以后，会有很多经验，我们制定的课程目标也会相应有所提高。

②确定课程内容的能力

确定植物组织培养课程内容或者说编制课程是一个创造过程，是教师对课程内容进行选择，并加以组织的过程。组织培养技术在高中生物课程中的很多章节都有所介绍，但没有一个完整的课程介绍组织培养的全过程，并且在高二上学期，学生刚开始学习生物，对组织培养很不了解，为了让学生初步了解组织培养的含义及过程，我们查阅大量资料，确定上课内容，制作植物组织培养多媒体课件，并且制定了教学进度。

③实施课程的能力

课程实施包括教学、学生自学、作业等形式，但最为重要的是教学。每次上课之前，我们都要先查阅资料如“培养基配方”、“母液的配制方法”、“培养基配制程序”、“外植体消毒和接种”等等，并将这些资料打印、分发给学生。通过教学不断地将打印的内容传授给学生，将静止的书面材料转化为具体的教学内容，在配制培养基、接种等方面指导学生进行实践操作，最终使它们成为学生的经验。另外，因为同学们从未接触过植物组织培养接种的过程，只在网络和图书上见过一些照片，为了让大家对组培有个初步地认识，我们还组织同学参观锦绣大地的植物组织培养车间，现场学习接种过程，效果极好。这些都大大提高了我们教师实施课程的能力。

④评估课程的能力

由于组织培养是基于学校而开发的，对我们而言，没有现存的经验可供参考，这就需要我们必须自己根据实际情况制定评价方案并实施评价。我们主要制定以下初步评价目标：

Ⅰ.评价学生，是否达到了预期的学习目标。

Ⅱ.评价课程，教学内容是否符合高中学生的学习特点，对学生的学习和能力培养产生的影响。

Ⅲ.自身评价，教学中如何引导学生，以后应如何编写相应的教材等。

(2)实验和研究能力

应该说，生物教师的专业水平距离生物专家还相差很远，组织培养课程的开发本身是一个教师参与科研的过程，它要求我们教师承担起研究者的任务，这对于教师研究能力的提高大有裨益。对于不同的学科，研究能力的含义是不同的，生物是一门实验性科学，在组织培养的课程开发中，我们教师不仅要研究学校、学生、自己，还要研究课程目标、课程内容、课程理论、课程开发方法等；不仅要研究问题的解决，还要研究交往、协调的方法等等。如植物组织培养用的Ms培养基，不同培养基所加的生长素和细胞分裂素的量是不一样的，为了达到效果，需要老师自己不断的摸索；培养基所加琼脂的量，不同的配方也不一样，而它又会直接影响培养瓶中培养基的硬度和瓶内湿度，这也需要我们教师自己摸索经验；又如外植体的切取时究竟切取哪一部分最合适，而且不同的植物适合取哪一部分的外植体，才更易分化和成活，也需要不断地查阅资料，实际探索，然后再指导学生操作。

再比如：学生在课程刚开始时，对接种的操作还很陌生，动作生疏，很多细节没有注意，结果接种的外植体大部分出现污染，这时我们没有直接让学生倒掉重做，而是坐下来认真分析失败的原因，经过反思，学生总结出“接种时，有说话现象；培养基瓶离开超净台；操作器械消毒不严格”是失败的主要原因，因此会在以后做实验时，特别注意接种的规范性。我们教师也通过此次教训，了解到了外植体接种过程中消毒彻底的重要性。

就是在这种不断发现问题、解决问题和查阅资料的过程中，教师的实验和研究能力逐步得到了提高。

2.校本课程的开展给教师带来了一系列新的

观念

校本课程是一种新的课程形态，比较注重学生本位，着眼于学生学习方式的改变，因而必然引起教学思想的变化。

组织培养课程是为学生开设的，我们生物教师所做的一切归根到底是为了提高学生的生物科学素养，促进学生较大限度的发展。所以参与校本课程开发有利于教师形成以学生发展为本的理念，建立新的师生关系。

互联网扩大了信息来源，教师不再是知识的、真理的化身。组培课程刚开始学习的时候，很多知识都是教师教给学生。随着课程的深入，学生资料的丰富，学生在实验的设计等方面的能力很可能超过教师，有时会把老师问倒。这就可能引发一种理念的重建：允许学生提出不同意见，甚至反对自己的意见，并想方设法使学生超过自己。

组织培养课程改变了学生原有的学习方式，采用的是研究性学习，这就必然会有这样那样的错误，因此教师要允许学生犯错，但最重要的是总结经验，下次不再出现同样的问题。如果一个学生只知唯师是从，而没有自己的观点，不敢也没有向教师质疑的习惯，那么不仅不利于学生自身能力的形成，也不利于生物教师的专业成长。

3.校本课程使教师改变了对知识本质的看法，而且为教师知识结构的改变提供了可能

(1)知识的本质

生物新课程的基本理念是“面向全体学生”、“提高学生科学素养”、“倡导探索性学习”，生物教学不仅要使学生获取一定的知识，还要使学生习得获取知识的方法，并使每个学生在其自身水平之上得到提高、获得发展。

同样，我们开展的植物组织培养课程重视的不是现存的、静态的知识，而是强调学生自身的体验；强调学生如何获取有用的知识；强调那些能够帮助学生思考与探索的东西。学生通过植物组织培养课程确实学会了组培的一些知识，能够进行组培的一些操作，但更重要的是学生在整个过程中体会到了科学研究的过程，养成了严谨的科研习惯，学会了一些分析问题、解决问题的方法。这应该是学生参与组培课程所得到的较大收获，也是我们老师所要达到的目的。

(2)知识结构的改变

教师参与植物组织培养课程的开发，首先要具有相应的植物组织培养的课程理论知识，而这些在现有教材只有少部分涉及，没有现成的完整的内容，需要自己从各个方面收集资料。因此为了使自己的工作更具有成效性，我们就不得不认真学习一些组培课程理论，如四中陈颖老师编著的《“克隆”与组织培养》一书，阅读其中大量的组培资料以完善自己的知识结构，以便用科学的理论指导自己的工作实践。这就必然引起教师知识结构的重组。

就知识角度而言，生物教师的知识一般可以分为三大类：一是指生物教师所具有的特定的学科知识，如我们在大学所获得的植物学、动物学、微生物学等方面的知识；二是教师所具有的教育学和心理学知识；三是生物教师在实际的教育教学工作中(包括研究性学习、选修课等课程中)获得的具有明显的经验性的知识，是教师经验的累积。这种实践性知识的获得正是教师专业发展的重要标准，因为对一个受过高等教育的生物教师来说，前二者的知识并不是太缺乏，教师专业发展主要是指获得更多的实践性知识。实践性知识的获得主要通过教师对自身教育教学实践的反思，而反思正好是校本课程开发所特别强调的。

植物组织培养课程是我校一项新兴的教学实践活动，我们没有现成的经验可以借鉴，整个开发活动具有极大的不确定性，因而经验的总结和反思就有其特殊的作用。生物教师可以在反思过程中对课程开发的过程具有更多理性认识，在课程目标确定的前提下，可以反思达到这些目标的方法，争取少走弯路，不断提高自己的实践性知识。

三、结束语

我校的植物组织培养课程刚刚起步，同那些开展了很多年的学校相比，我们做的工作还太少，实验教学经验也不足。但是通过该课程的实施，我们确实感到了它促进了生物教师的专业发展，相信随着我校组培课程的开展，我们的学生和生物老师都会在该课程中得到更大的收获。

植物组织培养论文:外来入侵植物黄顶菊种子的组织培养

摘 要： 本实验以黄顶菊种子作为外植体，首次对黄顶菊进行了组织培养。采用基本MS培养基，升汞消毒时间为4 min，在光照培养箱内采用不同温度下的光暗培养。结果表明，黄顶菊种子的组织培养较易成功，本实验确定了组培适合的培养基、消毒时间，以及培养条件。

关键词： 外来入侵植物 黄顶菊 种子 组织培养

黄顶菊［Flaveria bidentzs （L.） Kuntze］是近年来新发现的一种外来杂草，原产南美洲，也叫“南美黄顶菊”，有的地方群众也称“野菊花”，为一年生草本植物，分类学上属于菊科黄菊属（Flaveria），与万寿菊属天人菊属为近缘属。2001年首次在天津南开大学发现，日前在河北邯郸、邢台、衡水、沧州、廊坊、石家庄、保定等地不同程度发生，呈现以河北省中南部为中心向周边其他省市扩散趋势。“黄顶菊”根系发达，耐盐碱、耐瘠薄、抗逆性强，繁殖速度惊人，一株“黄顶菊”能产数万至数十万粒种子。“黄顶菊”能严重挤占其他植物的生存空间，有“黄顶菊”生长的地方，其他植物难以生存，一旦入侵农田，将威胁农牧业生产及生态环境安全［１］－［９］。

黄顶菊国内目前的研究主要集中在生理、生态、基础防除方面，还有生物活性和化学成分等少量研究。黄顶菊在生存空间上占有极强的生态位，其生物成分和化学成分具有抗菌、杀虫活性；另外对一些植物的发芽率及胚根的伸长有抑制作用，还对个别植物的胚根生长起到促进作用。从黄顶菊本身的生态特性及其提取物质的角度考虑，能否利用其体内的微生物，以及一些自身携带的物质来对某种生产上严重的病害进行防治实验研究，从而达到使黄顶菊变废为宝的目的，对其加以利用。本实验考虑到在非生长季节对黄顶菊进行更多方面的研究，避免外界环境因素对科研实验造成影响对黄顶菊进行了室内组织培养的探索。

1.材料与方法

1.1植物材料

黄顶菊种子，采自衡水湖码头。

1.2外植体的制备

将种子从植株上用双手轻轻地揉搓下来，去掉掺杂在其中的带有外表皮的种子，只将纯净的种子收集起来干燥环境下放置备用。

在无菌操作台上用75%的酒精缉浸泡30s，0.1%的升汞消毒3.5min，4min，5min，无菌水冲洗3-4次，置于无菌培养皿中晾干，以此作为组织培养的材料［１０］。

1.3培养基的配置

未加任何激素的基础MS培养基。

配制步骤为：MS培养基母液+加3%蔗糖定容调pH值至5.8加0.8%琼脂，加热溶解分装20ml封口高压灭菌（121℃，20min）接种［１０］。

1.4接种

在无菌操作台上将消毒好且晾干的种子，用无菌的镊子夹入到灭菌好的MS培养基上。封口后放入光照培养箱内培养。每瓶接种5粒种子。

1.5培养

将接种的三角瓶置于光照培养箱内，采用29℃下12h光照培养，26℃下12h黑暗培养，培养期为30d。

2.结果与分析

2.1升汞处理时间对外植体的影响

培养结果表明，升汞的处理时间不同（表1），外植体的出苗、生长状况和污染情况都不同。其中，处理4min的结果好，外植体污染率为0，幼苗生长较快，长势较好。处理3.5min的外植体污染率较高，说明消毒不彻底，造成出苗率较低。处理5min的外植体出苗率很低，也无污染，说明消毒时间过长。

②出芽率=出芽外植体数/接种外植体数×100

2.2种苗的污染

表1统计的污染率为外植体处的污染率，表明50%的污染率是由于升汞消毒时间的处理不当造成的，在25天的统计时，出现了培养基少量青霉等真菌的污染，推断培养基、实验器材的消毒都达到标准，不是造成污染的主要原因。所产生的污染主要是由于操作中偶尔出现的不规范操作所造成的，应该在操作中尽量严格规范，避免污染。

2.3种苗生长状况

实生苗在营养丰富的普通MS培养基上长势较好，15天左右的苗高可达0.5cm，30天的苗高可达1.5cm左右，有些可达2cm，但幼苗大部分较细弱，本实验在后期的组培苗培养中将尝试生长激素的加入，以促进苗木的增粗增长。

3.讨论

组织培养过程中，选择适当的培养基种类，激素的种类及添加量等时组培成功的关键。本文选择组织培养用普通培养基MS，因为为初次对黄顶菊种子进行培养且考虑到激素可能对后续实验的影响，所以本实验没有使用生长激素。

升汞的消毒时间是影响黄顶菊种子组培成功的关键。

本次实验的造成污染的主要原因是种子消毒的不彻底，另有部分污染是由于操作过程中不规范的动作造成的。这提醒我们在组织培养的过程中，严格规范的操作程序也是影响组培苗成活及后期生长成功的关键因素。另外培养基的彻底灭菌和操作器皿的严格消毒也是不容忽视的因素［１１］。

由本实验结果可知，黄顶菊种子的组织培养是比较容易成功的，这为我们在黄顶菊的非生长期内进行科学研究奠定了基础。

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植物组织培养论文:植物组织培养中常见问题与对策

摘要：从植物组织培养中常见的污染、褐化、玻璃化现象等问题入手，分析了其形成的原因，并结合自身工作经验提出针对性的解决策略，对植物的组织快繁和工厂化育苗具有一定的参考意义和借鉴价值。

关键词：组织培养；污染；褐化；黄化

1 污染问题及对策

1.1 污染原因分析

控制污染是组培过程中的首要技术。造成污染的原因很多，如外植体的种类、取材的季节、时间、预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、消毒时间以及消毒方法、培养基和器皿灭菌、操作人员、工作环境的要求、超净工作台的工作质量等都与污染密切相关。一般来说，组培污染源分为3大类：材料带菌、接种污染、培养过程感染。

1.2 对策

选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。对母株预处理，改善植株栽培环境，对母株喷布杀菌剂或抗生素。改变灭菌方法，使用真空减压灭菌、多次消毒灭菌、混合消毒液、灼烧等。在培养基中加入其它抑菌剂。切分潜在的带菌材料时，要保障所用的接种工具已经过彻底的消毒；继代培养时确保污染的材料应给予丢弃。针对接种污染，要做到紫外灯接种室消毒，清洗超净工作台；接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触；接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75 %的酒精喷洒双手，接种时应穿上无菌的白大衣，戴上帽子和口罩；无菌室要注重平时除湿和熏蒸消毒工作。培养过程中要定期对培养室进行消毒处理，及时清除污染材料，污染的材料及仪器必须经过药液消毒后方可使用。

2 褐化问题及控制措施

2.1 褐化概念及原因分析

褐化是指在植物组织培养过程中，外植体在诱导脱分化或再分化时，自身组织由其表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化一般分为2种：由于细胞受胁迫或其它不利条件影响所造成的细胞死亡而形成的褐化现象；由于酚类物质被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影响褐化的因素一般与基因型、外植体情况、培养条件、培养基有关。如温度对褐化影响很大，高温能使 多酚氧化酶的活性提高，促进酚类氧化；而低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，减少酚类氧化，从而减轻褐化。

2.2 控制措施

多选择幼龄植株取材，使外植体处于旺盛的生长状态，可大大减轻褐变。在植株的一定部位取材，使材料中酚类物质含量较低，也有助于减少褐化。对母株进行遮光处理，不仅利于初代培养物的萌发，还可减轻褐化程度。利用硫代硫酸钠、植酸、抗坏血酸等抗氧化剂、活性炭等吸附剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，可减少或减轻褐变。实验证明，琼脂量的减少、较低的pH值也有利于减少褐变。选取适宜的培养条件如适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化，采用45℃以上的短时间高温处理也能使多酚氧化酶失去活性，达到抗褐变的目的。

3 玻璃化现象及解决途径

3.1 “玻璃化现象”内涵及发生原因

玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状，组织结构发育畸形的现象。玻璃化的苗因组织畸形，分化能力降低，移栽后也很难成活，所以不宜用作继代和移栽的材料。它已成为组培工作的一大难题，目前其根本原因尚无定论。根据吴若菁等[1]对香石竹的组培研究得知，影响组培苗玻璃化的原因主要与激素的种类、浓度、琼脂的浓度、外植体的取材部位、不适宜的培养条件有关。

3.2 解决途径

可从以下几个方面降低或防止玻璃化现象的发生。①利用固体培养，调节培养基的 pH值，提高琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，提高培养基的碳氮比，降低 NH4+浓度，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分；③降低培养器内部环境的相对湿度，保持适宜温度，改善氧气供应状况，减少玻璃化苗的出现；④适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度；⑤利用高于40℃的温度对外植体热击处理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，实验证明，玻璃苗放于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化现象可逐渐消失，这可能与自然光中的紫外线有关；⑦改善培养容器的通风换气条件，如用通气好的封口膜封口。

4 其它问题及相关对策

如黄化现象和变异率高的问题。培养基中 Fe含量不足、培养环境通气不良、培养温度不适、激素配比不当、糖用量不足、光照不足等都会造成黄化现象。只有找出问题的根源对症下药才能从根本上解决问题。关于变异率高的问题，不仅不利于保存资源和培育优良的品种，还会严重影响工业化生产的组培苗的质量，必须从原始材料、培养基配方、增殖代数、愈伤组织等方面严控变异率的发生。

植物组织培养论文:植物组织培养及其在果树上的应用

摘要植物组织培养是指利用细胞全能性培养再生植株的技术，由于其具有快速繁殖、产生脱毒苗、培育新品种、克服杂交不亲和障碍和保存种质资源等应用优点，在果树应用上有重要的价值。通过介绍植物组织培养在果树上的应用，以为今后研究提供参考。

关键词组织培养；果树；应用

植物的组织培养是利用无性生殖原理，使植物组织在人工控制的条件下，通过细胞的增殖和分化，快速发育成新植株，是近几十年来发展的新技术。利用植物组织培养技术在培育植物新品种和改良种性方面具有巨大的潜力，细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，不仅可以生产大量的优良无性系，保留植株的优异性状，并可获得药用价值高和工业生产所需的次生产品；组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料。应用植物组织培养技术分离单倍体细胞，能选择突变体，提高植物的品质，增强抗盐、抗旱、抗寒等方面的能力，扩大植物的生长范围；培育纯合的二倍体优良品系，缩短育种时间；通过低温冷藏体细胞，建立优良的基因库，由此保存物种和种质资源。该文主要介绍植物组织培养在果树上的应用，并提出今后的研究方向，可为今后的研究提供参考。

1植物组织培养概述

植物组织培养是指利用细胞全能性培养再生植株的技术，具有培养条件可人为控制、生长周期短而繁殖率高、管理方便等特点，其步骤可分为培养基配制、灭菌、接种、培养、驯化移植。在培养时可能会出现褐变、材料玻璃化等现象。

近年来，随着科学技术的迅猛发展，植物组织培养技术已进入生产应用阶段，广泛用于科研和生产，近期应用的技术有快述繁殖、体细胞胚的发生、脱毒、胚培养、单倍体育种、种质贮存与运输以及细胞代谢物的生产等，而体细胞无性系变异、通过原生质体融合进行基因转化、通过农杆菌或其他手段向植物导入基因等又是很有发展趋势的新技术。

2植物组织培养在果树上的应用

20世纪60―80年代，在林业、农业、园艺等学科领域已广泛应用植物组织培养技术，许多花卉、林木、果树、蔬菜都可通过组织培养进行大规模离体快繁，试管苗已在国际市场形成产业化。国内外学者先后开始果树组织培养技术的研究，目前已有很多关于果树组织培养的研究报道。

2.1植物组织培养在苹果上的应用

苹果是我国重要的果树栽培树种，但单产低，品质差，严重影响苹果生产的发展。通过育种手段选育优良的品种和砧木是解决存在问题的重要途径。原生质体培养及融合技术能扩大遗传重组范围，促进远缘性状的有效转移，在应用于育种实践时显示出巨大的应用潜力。

苹果是落叶果树中原生质体分离及培养研究比较早的树种。Niizeki等[1]于1983年首次分离苹果品种“Orel”的花药愈伤组织原生质体，经培养获得愈伤组织。费开韦等[2]于1980年在元帅苹果花药培养上获得植株，为国内外首次获得大苹果单倍体植株。截至目前，已有12个苹果基因型的原生质体经培养再生成植株。

组织培养能实现苹果的快速繁育，尤其对特殊种植及苹果矮化砧木的扩繁有重要意义。高兵等[3]通过研究不同消毒方法、消毒时间、防褐化措施、激素配比对组培苗的影响，从而获得嘎拉苹果单芽系组培苗。徐世彦等[4]以MS为基本培养基，取高酸苹果茎尖和茎段做外植体，进行离体快繁研究，挑选确定其分化、生根培养基的激素组成及各激素的比例关系，并且成功地进行试管苗的移栽，且移栽成活率达到93.8 %以上。红肉苹果[5]、苹果矮化砧GM256[6]等其他特殊苹果种植的组织培养与快繁技术也在进一步研究中。

组织培养可作为苹果脱毒的重要手段，生产无病毒苗木。周厚成等[7]以MS为基本培养基，以观赏性小苹果“特丽”的茎段为外植体，建立小苹果“特丽”的无菌培养体系。张庆田等[8]以苹果砧木M9、M26为试材建立其各自的无菌体系。

组织培养是实现细胞工程诱变的重要手段，对苹果新品种的获得有重要意义。李宗伟等[9]利用组织培养技术获得扎矮山定子（Malus baccata）与平邑甜茶（M.hupehensis）杂交后代的优系93-10和93-24，提供了一种苹果属创新无融合生殖矮生砧木资源。

2.2植物组织培养在桃上的应用

杨宁等[10]对扁桃砧木试管苗生长的培养条件进行优化选择，表明组合为6-BA 1.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA3 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L；极差分析结果表明，4个因子的重要性依次为6-BA、GA3、蔗糖、IAA。赵胜利等[11]于2008年初步建立山毛桃离体再生体系，研究结果表明：桃种子消毒方法为75%酒精（30 s）+0.1%HgCl2（5 min）+无菌水（24 h）+0.1% HgCl2（3 min）；种子去除种皮的萌发率较高；芽苗的增殖培养基为G+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；桃成年茎段诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L十NAA 0.01 mg/L。桃保存培养基为G+KT 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。

2.3植物组织培养在葡萄上的应用

培育品质苗木是葡萄品质生产发展的基础和关键，而选择培养基是建立良好的葡萄组培快繁体系和再生体系的主要工作之一，由此再进行葡萄离体培养。在葡萄快繁研究中，国内外多采用MS、B5等培养基，同时应用各种细胞分裂素和生长素。法国的Georges Morel首先对葡萄进行组织培养，提出葡萄愈伤组织培养所需要的适宜生长素浓度。曹孜义等于1979年在国内首先报道葡萄试管繁殖技术，并于1980年建立我国及时个植物组织培养的葡萄园，而后有关葡萄茎尖快繁的研究越来越多。刘培德等[12]对贵人香、白羽等24个葡萄品种的茎尖进行再生研究，认为葡萄茎尖再生成功较易，只要是从旺盛生长的新梢上取下茎尖，接种到含有一定浓度的BA和NAA的MS培养基上，就能顺利完成茎尖分化、芽丛形成和生根成苗。至今，葡萄茎尖离体培养已作为一项成熟的生物技术被运用到各个品种的研究，曹孜义等[13]于2002年研究获得9个月繁殖2.32万株生产用苗的结果，使葡萄试管苗工厂化生产达到更高的水平。

2.4植物组织培养在梨上的应用

赵胜利等[11]于2008年初步建立鸭梨高效再生体系，研究结果表明：梨种子在离体培养时需去除种皮，萌发培养基为MS+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L，发芽率为86.67%；增殖培养基为L2，即Ms+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L；生根诱导培养基为G3，即1/4 MS+NAA 0.3 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L；生根数诱导培养基为1/2 MS+IBA 0.4 mg/L +蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L。同时该试验还研究鸭梨试管苗离体种质保存，结果表明：利用光照强度500 lx、添加活性炭3 g/L、大量元素减3/4、添加PP333 10～15 g/L琼脂+水的空白培养基、添加甘露醇10 g/L结合30 g/L蔗糖、添加琼脂8 g/L、添加甘露醇60 g/L、添加ABA 0.5 mg/L等方法对梨试管苗进行保存，好的已保存6个月，存活率在95%以上[11]。

2.5植物组织培养在核桃上的应用

核桃是世界四大干果之一，具有很高的营养价值和经济效益，但利用无性繁殖较困难。因此，在核桃的生产中长期采用实生繁殖，通过扦插的核桃苗很难生根，嫁接成活率不稳定，导致良莠混杂、品种退化，严重制约我国核桃品种化的发展。随着组织培养技术的兴起，从20世纪60年代末期逐步开始研究核桃组织培养。Driver于1984年首次培养出奇异核桃生根苗。在国内，刘淑兰等也以沙培实生苗及成年树茎尖诱导出无根苗。张燕研究认为，采用80 μg/L青霉素和3 g多菌灵浸泡处理核桃外植体，控制污染的效果显著。田爱梅研究指出，在培养基中加入5 mg/L抗坏血酸可有效抑制培养物褐化；采用诱导期暗培养、降低无机盐浓度、添加活性炭等措施能有效地促进核桃芽苗的生根率。而张满让等[14]则应用WPM培养基培养早熟油桃，其较高萌发率为95.56%。

2.6植物组织培养在枣上的应用

在枣的生产中，传统的育苗方式繁殖系数低，育苗速度慢，且浪费材料。近些年来，随着红枣的迅速发展，亟需大量品质苗木，为了满足红枣产业快速发展对苗木的需求，组织培养技术为快速育苗提供了一条新出路。

1980年，中国科学院植物研究所成功地在酸枣的组织培养中诱导大量的胚状体，这是有关枣树组织培养的最早的报道，以后此方面的工作得到广泛的开展。其中发展最快的是利用枣树的营养器官（茎段、茎尖）进行器官培养，建立快繁体系的研究工作[15]。

张福泉于1983年首次报道用枣茎段离体培养并获得完整植株的研究。孙浩元以桐柏大枣为研究材料，以MS为基本培养基，对每个培养阶段的培养基配方进行研究。段乃彬[15]研究认为，以枣头茎段和根蘖茎段为外殖体，采用同样的灭菌方式，根蘖茎段可极显著地降低污染率。周瑞金首次建立辣椒枣离体叶片再生体系和高效的冬枣叶片再生植株快繁体系。随着对枣组织培养的不断深入研究，将会加快优良枣树苗木的繁殖速度，从而进一步促进枣树规模化发展。

2.7植物组织培养在其他果树上的应用

应用组织培养技术进行植物离体快繁，现已被世界上很多苗圃用于多种果树繁育，除了所提到的应用于苹果、桃、葡萄、梨、核桃、枣外，其应用于杏树[16]、柿树[17]、樱桃[18]、柑橘[19]、李[20]等其他果树也有相关报道。

3结语

随着植物组织培养技术的迅猛发展，果树的组织培养技术已由实验室走向商业化生产，成为现代生物技术的一个重要组成部分。随着植物基因工程研究的迅速发展，将离体培养技术与分子生物学方法相结合，在细胞水平上进行遗传修饰重组DNA，可以达到改良果树品种的目的。人们力图通过基因工程的方法获得抗性强、产量高、品质优良的果树新品种，随着植物细胞工程与基因工程的结合，更大程度地提高了基因转化的成功率。随着科学技术的不断进步，果树组织培养技术发展水平将会得到进一步的提升，在果树生产中将发挥更大的作用。

植物组织培养论文:植物组织培养基中添加蔗糖的原因

高中生物的质壁分离实验中，用的分离剂是蔗糖溶液，能使成熟的植物细胞发生质壁分离，但因为蔗糖不能进入植物细胞内，故不能自动复原；而在植物组织培养时，培养基里要加入蔗糖，难道就不会发生质壁分离吗?那么植物组织培养时植物细胞如何吸收利用蔗糖?

植物组织培养的初期(即再分化之前)，用于培养的外植体(用于培养的离体的植物组织、器官或细胞)基本上不能进行光合作用，需要在培养基中添加一些碳水化合物以供植物正常生活的需要。培养基中的碳水化合物通常是蔗糖，蔗糖除作为培养基内的碳源和能源物质外，对维持培养基的渗透压也起重要作用。

蔗糖能进入植物细胞被利用吗?早在20世纪40年代，有人曾做过这样的实验：将标记的蔗糖溶液直接喷洒到叶表面，剥去一小片叶表皮或角质层，蔗糖溶液就能进入细胞，这与外植体从培养基中吸收蔗糖极其相似；研究人员在叶片的韧皮部发现了一系列蔗糖运输载体，包括菠菜蔗糖载体、马铃薯蔗糖载体StSUT1、车前草蔗糖-H+共运输载体PmSUC2和2个拟南芥蔗糖运输载体suc1和suc2；另有学者证明：在0.3g／mL(相当于30％)蔗糖溶液中，植物细胞发生质壁分离后可自动复原；另外在植物体内的茎和叶中都能够合成蔗糖，是光合作用的主要产物之一，并且可以向其他部位运输转移，也是植物体内运输的主要形式；这些实验都充分表明了植物细胞可以吸收蔗糖(而在高中一般是说蔗糖分子不能进入细胞的)。

蔗糖分子是通过次级主动运输形式直接被植物细胞吸收。次级主动运输是细胞利用初级主动运输的ATP酶或质子泵建立的质子梯度进行的物质运输，并非直接利用ATP水解释放的能量。经科学家研究，其吸收过程大致如下：质子泵将质子泵出细胞，胞外形成较高的质子浓度，建立起细胞内外的浓度梯度，这样，胞外的质子顺着浓度梯度趋向于向胞内扩散。细胞膜上的特殊载体(蔗糖一质子同向共运输载体)除运输质子外，连同蔗糖一起转运至细胞内，这是一种蔗糖一质子同向共运输。

植物组织培养中之所以以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因：首先，同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。其次，植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。再次，诱导作用，在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。

植物组织培养中，培养基中的蔗糖浓度较低的，一般为3％～10％，而质壁分离中的蔗糖浓度为30％，可见两者浓度差距之大，质壁分离由于时间短，吸收速度缓慢，细胞吸收的量很少，而不是不能吸收，不足以对细胞液渗透压造成影响，才会出现质壁分离现象。因而只要浓度不是过高，时间又足够长，那么蔗糖就可以进入植物细胞内而被植物利用。同时植物体内有蔗糖转化酶，可以吸收和利用蔗糖，而且转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用，研究表明，转化酶参与植物的生长、器官建成、糖分运输等多项功能，因此在植物培养基中加蔗糖。

植物组织培养论文:植物组织培养实验教学创新体系的研究

摘要：对植物组织培养实验教学创新体系进行了研究，通过制订科学合理的实验教学大纲、优化实验教学内容、建立开放式实验室及改革考核办法，来强化实验教学效果，提高学生的实验素质、科研素质、创新意识和创新能力、集体观念和团队精神，提高教学质量，培养学生的综合实验技能。

关键词：植物组织培养；实验教学；综合技能

植物组织培养开创于植物生理学家Gottlied Haberland的细胞培养实验，随后各国学者经过半个多世纪的努力，终于观察到胡萝卜悬浮培养细胞的体细胞胚胎发生（Steward等，1958），并获得黏毛烟草（Nicotiana glutinosa）和普通烟草杂种来源的单细胞再生植株（Vasil和Hildebrandt，1965），这些研究不但科学地论证了Haberland的细胞全能性理论，而且逐步完善了植物组织培养技术。在近半个世纪中，植物组织培养应用研究的各个领域得到突飞猛进的发展，推动了植物组织培养在植物育种、苗木快速繁殖和有用次生代谢产物生产等方面的应用。同时，植物组织培养又是植物基因工程和植物分子生物学研究的重要基础之一。没有植物组织培养技术，很难想象转基因植物等许多研究能到如此迅速的发展。由此可见，植物组织培养来源于实验科学，它是一门实验性、实践性很强的技术类课程，要求学生具有很强的实验动手能力，因此，植物组织培养的实验教学是这门课程教学的关键环节。张红探讨了植物组织培养实验教学大纲的制订、强化技能训练、改革考核办法；陈刚，冷春玲强调了开放式植物组织培养实验室有利于开拓学生的创新能力及实验技能的提高；姚晓惠，徐凌飞提出增加综合性实验，优化实验教学内容，改进教学过程，成立兴趣小组等有关植物组织培养课程的实践教学方法。梁称福等就植物组织培养课程教学方法进行了探讨，从不同角度进行了植物组织培养理论教学的研究，探讨了植物组织培养课程特色、教学与创新教育的实践及课程教学方法。宋江华，张延红等分别探讨了园艺植物、药用植物、园林植物等组织培养学课程教学过程中教学改革的思考与探索。尽管有关植物组织培养的理论教学及实验教学开展了一些研究，但是，缺乏系统性和可操作性研究。随着生物技术在科研与生产实践中广泛的应用，植物组织培养实验技能亟待加强，植物组织培养的实践教学需要不断完善，培养适合生物技术在科研与生产上急需的人才。针对以上需求及我们多年从事植物组织培养的教学与科研工作的经验，来开展植物组织培养课程实验教学创新体系的构成和实践研究，以满足社会对这类人才的需求。

一、调整完善植物组织培养的实验教学大纲

教学大纲是根据学科内容及其体系和教学计划的要求编写的教学性指导文件，科学合理的实验大纲是提高教学效果的重要保障。植物组织培养实验教学既要注重学生基本实验技能的训练，又要培养学生独立思考和解决问题的能力。所以，根据植物组织培养课程的特点及目前学科发展的需要可以看出，调整优化实验教学大纲势在必行（见表1）。植物组织培养作为生物类专业（林学、花卉、园林、园艺及蚕桑等）的专业课，其学时一般为36学时，其中理论学时为27学时，实验学时仅为9学时，植物组织培养的实验耗时较长，一般需要3学时，9学时仅能开3个基本实验，设计型、综合型的实验根本没有条件开，这样极大地限制了学生学习植物组织培养的热情，同时很难使学生真正而系统地掌握植物组织培养理论及实验技能。根据学科的发展及课程理论及实验的要求，认为该课程学时设定为2.5学分较为合适（即45学时），其中理论学时为36，实验学时为18，理论上11章，实验开设6个。

二、优化实验教学内容，增加综合性、设计型实验

将实验内容分为3个模块，即基本技能（也称为验证性）模块、单项技能（设计型）模块、综合技能（综合型）模块，统筹兼顾了植物组织培养各个环节技能的培养。除基本技能项目外，单项技能与综合技能项目都是在教师明确实验目的及注意事项后，由学生自选材料、自主确定实验环节（初代培养还是继代培养）、自主设计培养基配方，并优化组培成本核算，以项目教学法的形式开展实验活动。设计性、综合性和创新性实验达到80%以上。

三、建立开放式实验室，提高学生的综合技能

建立开放实验室最突出的特点是，学生选择自己感兴趣的实验而且有了自己可以支配的时间，从而调动学生的积极性，让学生自己设计自己感兴趣的实验或是有一定难度但是可以自行解决的实验，依据其操作步骤进行实地操作，提高其解决科学问题的能力，在实践中收到了良好的效果。

1.实验素质的提高。开放式实验室的建立首先是注重学生实验素质的提高。实验素质是指学生进入实验室的基本素养，具备良好的实验素质是有效实施开放式实验室的前提。

2.科研素质的提高。在开放式实验室，学生们先后参与了教师的科研项目“地被植物欧石楠优良品种的引进及繁育技术”、“红掌优良品种的快速繁殖及新品种选育”等项目的研究。通过参与实验、通过现象观察、数据的调查，在发现问题、解决问题过程中学会了查阅相关文献资料，并采取自己掌握的科学方法认真总结归纳实验结果等，提高了学生的科技水平素质，提高了其就业竞争力及实践动手能力。在走入工作岗位后，有多名学生从事植物组织培养等相关技术工作，并有部分同学在就业单位担任技术骨干。还有些同学考取了研究生，从事分子生物学方面的工作，由于有植物组织培养技术方面的训练，实验能够很快上手，受到指导教师及其学长的肯定，对其迅速的生长具有重要的推动作用。学生通过亲自参加科研活动，掌握了科学研究的基本方法，开拓了科研思路。现今组培企业的发展需要大量的技术管理人员和研发人员，为学生的创业和就业提供了大量机会，我院每年都有部分学生被组培企业所吸收。

3.创新意识和创新能力的提高。结合学校大学生科技创新项目及泰安市科技创新引领项目的研究，培养了学生的创新意识，提高了学生的创新能力。例如，学生参加了山东农业大学大学生研究训练（SRT）计划项目“窄冠黑白杨组培快繁及再生体系的建立”、“欧石楠体细胞胚胎发育的研究”；泰安市大学生自主创新引领项目“猥实成熟种子愈伤组织诱导与植株再生的研究”、“欧石楠甲基化的研究”、“珍稀濒危树种青檀繁育技术研究与开发”、“常绿地被开花植物―欧石楠引种及繁育技术研究”等。培养学生的创新精神和实践能力，促进学生知识、能力与素质的发展。在大学生科技创新项目及泰安市科技创新引领项目的带动下，在学生中组建实践小组，先由小组组织并开展实践活动，即首先掌握植物组织培养的基本技术及基本的操作环节，如，培养瓶的清洗要求，培养基母液的配置，固体培养基的配置，外植体的采集，培养基、接种工具及无菌水的灭菌技术。学生在兴趣小组实践中使理论学习与科技实践都有了一个很大的飞跃，巩固加深了对书面课堂理论知识的应用和理解，促进了实践技能的掌握、提高与创新，培养了学生的创新意识，提高了学生的创新能力。

4.集体观念和团队精神的提高。植物组织的培养有一个重要的特点就是持续的时间较长，比如，外植体的初代培养，一般的材料需要持续30天左右，在这期间会出现外植体的污染、褐化、玻璃化及材料的萌动、愈伤组织的形成、芽的分化等，需要给予适宜的培养条件及人为的操作，无误及周期性的更换培养。因此，可采取在学生中成立实践小组，利用平时的课余时间一起进行实验项目的分工及操作，保障实验材料适时转接及污染材料的及时处理；利用平时的课余时间及周末休息时间和节假日，配置培养基、高压灭菌、无菌接种，适时转接，及时观察分析，保障整个实验的顺利进行，这都需要团队的整体配合及分工协调，在分组实践中既培养了学生的协作意识和团队精神，又锻炼了他们吃苦耐劳和献身科学的精神，使他们在一次次的探索实践中不断克服挫折、调整心态、锐意进取。

四、改革考核办法，加大实验教学的比重

为了使实验成绩能如实地反映出学生的客观实际水平，改变以往仅以实验报告作为实验成绩，采取多种考核方法相结合的形式，以提高学生的实验技能，客观反映学生的实际水平。采用综合评定的方法确定学生的实验成绩，例如将实验报告或实验设计方案、实验操作过程中的表现及实验结果和集中考核三者结合起来评定。我们将组织培养的一些基本实验技术作为技能考核内容。随着教学经验的积累和实验教学条件的改善，我们相信植物组织培养课程的实验教学质量必将更上一层楼。

作者简介：李际红，女，山东农业大学林学院教师，博士，副教授，主要从事林木遗传育种与生物技术的教学与科研工作。